微孔板式微生物法與國標微生物法測定 嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的比較

◎ 郭瑩瑩，楊 光，李興霖，王玉芝，王哲明，趙 平

（黑龍江省質量監督檢測研究院，黑龍江 哈爾濱 150028）

泛酸屬于水溶性維生素，在體內主要以輔酶A形式參與代謝。泛酸是人、動物及微生物必需的營養物質，作為營養添加劑，被廣泛應用于食品中[1-3]。泛酸缺乏時可能誘發腦部受損、頭痛、嘔吐、疲勞、食欲不振、舌炎、胃酸缺乏和皮炎等，尤其是在嬰幼兒發育時期表現明顯。嬰幼兒配方乳粉作為嬰幼兒攝取營養物質的主要來源，各國非常重視，故對維生素添加量的監控十分重要[4-5]。

嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量測定的方法主要是微生物法和高效液相色譜法，而微生物法靈敏度高、受基質干擾小，是國家標準及AOAC（美國分析化學家協會）方法測定嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的指定方法[6]。

微孔板法是利用微生物方法，在微孔板中定量檢測嬰幼兒配方乳粉中的泛酸含量的方法。相比于國標微生物法，微孔板法具有操作簡便、降低成本、提高工作效率的優點[7]。本實驗主要通過采用實驗室開發的微孔板式微生物法與國標微生物法對質控樣品和不同品牌的市售嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的測定的比較，來分析實驗室開發的微孔板式微生物法在測定嬰幼兒配方乳粉泛酸含量中的準確度。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

SQP精密天平（德國Sartorius公司）、KQ5200DE超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）、PB-10pH計（德國賽多利斯公司）、T6新世紀紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、2266潔凈工作臺（上海拜艾斯）、MX-S渦旋振蕩器（美國Scilogex公司）、HPS-400生化培養箱（哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）、PHOMO酶標儀（鄭州安圖生物股份有限公司）及微量移液器（德國Eppendorf公司）。

1.2 材料與試劑

SRM 1849a質控樣品[美國NIST，含量范圍（6.82±0.19）mg/100 g]；不同品牌的5種市售嬰幼兒配方乳粉；Millex-GP一次性無菌濾器（美國Millipore公司）。

植物乳桿菌ATCC 8014（美國Microbiologics公司）；泛酸鈣標準品（99.0%，北京曼哈格生物科技有限公司）；乳酸桿菌瓊脂（美國BD公司）；乳酸桿菌肉湯（美國BD公司）；泛酸測定培養基（北京路橋公司）；無水乙醇（分析純，天津市天力化學試劑有限公司）。

1.3 國標微生物法

采用《食品安全國家標準食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2016）[8]第一法微生物法對質控樣品與5種市售不同品牌嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量進行測定。每個樣品進行7次平行測定，計算平行測定結果及結果間的相對標準偏差RSD。在一個樣品中加入標準中間液進行加標回收實驗，測定結果并計算回收率。

1.4 微孔板式微生物法

1.4.1 測試菌液的制備

按《食品安全國家標準食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2016）[8]第一法微生物法中接種液的制備方法制備測試菌液，并將測試菌液的透光率在550 nm處調節至30%～35%，備用。

1.4.2 標準曲線的制備

參照《食品安全國家標準 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2016）[8]第一法微生物法中標準曲線濃度點設置標準濃度點，見表1。以各標準濃度點吸光度為橫坐標，各標準濃度泛酸含量為縱坐標繪制標準曲線。

表1 標準曲線系列濃度表

1.4.3 培養、測定與計算

用8聯排微量移液器在微孔板的每個微孔中加入5 μL制備好的植物乳桿菌（ATCC 8014）測試菌液，再用8聯排微量移液器移取150 μL已制備泛酸測定培養基于微孔中，用微量移液器移取150 μL系列濃度的標準曲線工作液與適當稀釋的樣品溶液于指定的微孔中，加液完畢后，用微孔板封口膜封好微孔板，置生化培養箱37 ℃黑暗環境中培養24 h。培養后將微孔板充分振蕩混勻，揭開微孔板封口膜，用移液器槍頭去除微孔中表面氣泡，利用酶標儀在550 nm波長下讀取各微孔的吸光度。以吸光度為橫坐標、泛酸含量為縱坐標繪制標準曲線，參照《食品安全國家標準 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2016）[8]中第一法微生物法的計算方法計算樣品泛酸含量。

依據本方法，對5種不同品牌市售嬰幼兒配方乳粉和質控樣品進行泛酸含量測定，每個樣品進行7次平行測定，并對一種樣品進行加標，測定并計算回收率，通過精密度實驗及加標回收實驗來評價本方法。

2 結果與分析

2.1 國標微生物法結果

2.1.1 精密度實驗結果

5種不同品牌的市售嬰幼兒配方乳粉及質控樣品中泛酸含量的測定結果見表2，各樣品結果間無顯著差異，RSD為1.14%～2.34%，方法重現性較好，精密度較高，且定值質控樣品的實測值在含量范圍（6.82±0.19）mg/100 g內接近于定值，說明國標微生物法準確度較高。

2.1.2 加標回收實驗結果

對市售嬰幼兒配方乳粉進行泛酸加標，采用國標微生物法對其泛酸含量進行測定并計算回收率，測定結果如表3所示，加標回收率為97.6%～100.3%，平均回收率為98.96%，RSD為1.10%，回收率接近100%，說明國標法的系統誤差小，重復性好，準確度高。

表2 國標微生物法精密度實驗結果表

表3 國標微生物法加標回收實驗結果表

2.2 微孔板式微生物法實驗結果

2.2.1 精密度實驗結果

微孔板式微生物法測定不同品牌的嬰幼兒配方乳粉和質控樣品中泛酸含量的實驗結果見表4，各樣品結果間無顯著差異，RSD為1.34%～2.45%，說明本方法具有良好的重現性，精密度較高，且定值質控樣品的實測值在含量范圍內接近于定值，說明微孔板式微生物法準確度較高。

表4 微孔板式微生物法精密度實驗結果表

2.2.2 加標回收實驗結果

微孔板式微生物法加標回收實驗結果如表5所示，回收率為93.2%～106.3%，平均回收率為101.0%，RSD為4.32%，回收率接近100%說明方法的系統誤差小，重復性好，準確度高。

表5 微孔板式微生物法加標回收實驗結果表

2.3 方法結果比較

采用兩種方法測定不同品牌的嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的結果如表6所示，各樣品的泛酸含量結果的平均值接近，兩方法測定各樣品結果經F檢驗，P＞0.05。采用雙樣本等方差t檢驗對兩方法各樣品結果進行分析P＞0.05，應用兩種方法在測定嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量上無顯著差異，說明兩種方法相近，微孔板式微生物法可以替代國標微生物法應用于實驗室中測定嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量。

表6 方法結果比較表

3 結論

通過國標微生物法與微孔板式微生物法對5種市售不同品牌的嬰幼兒配方乳粉及質控樣品中泛酸含量進行測定，結果表明兩種方法的準確度較高；且兩種方法測定的每種樣品的7個平行結果間的RSD值為1.14%～2.34%與1.34%～2.45%，方法重復性較好，精密度較高，且平行結果間均無顯著差異；兩種方法的平均回收率分別為98.96%與101.0%，都接近于100%，說明方法的系統誤差較小。且兩種方法測定各樣品泛酸含量的結果較接近，經F檢驗與t檢驗分析，兩方法在測定嬰幼兒配方乳粉中無顯著差異。結果表明采用的微孔板式微生物法在測定嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量上與國標微生物法具有相同的效果，結果準確可靠、方法重現性好、系統誤差小，能夠應用于日常嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的測定中，減少工作量，提高工作效率，降低實驗成本。