發酵溫度對瑪納斯產區赤霞珠、美樂干紅中 白藜蘆醇含量的影響

◎ 王曉軍，劉宗昭，張如意，盧丕超，孟 麗

（1.新疆中信國安葡萄酒業有限公司，新疆 瑪納斯 832200；2.新疆釀酒葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，新疆 瑪納斯 832200）

白藜蘆醇（Resveratrol），又稱芪三酚、3，4，5-三羥基-1，2-二苯乙烯（3，4′，5-Trihydroxystilbene），是一種天然多酚化合物，其存在兩種構象，順式和反式。白藜蘆醇反式異構體比順式結構穩定；相對于順式結構，反式白藜蘆醇在自然界中更豐富、更具生物活性[1]。白藜蘆醇存在于各種食品中尤其在紅葡萄中，是一種強有力的抗氧化劑，主要存在于葡萄皮中。紅葡萄酒中普遍含有白藜蘆醇，藥理研究發現，白藜蘆醇對于炎癥、過敏[2]、血栓、氧化等方面有很好的保健功效[3-4]。

關于葡萄酒中白藜蘆醇的研究很多，但針對瑪納斯產區葡萄酒中的白藜蘆醇含量測定較少。本文利用高效液相色譜技術對瑪納斯產區赤霞珠和美樂干紅葡萄酒中的白藜蘆醇測定方法進行了初步摸索，并利用選定的色譜分析條件對瑪納斯產區不同發酵溫度下釀造的赤霞珠和美樂干紅葡萄酒中的白藜蘆醇進行測定。

1 材料與方法

1.1 儀器

HPLC系統（色譜柱Shim-pack VP-ODS、紫外檢測器SPD-10Avp、日本島津公司）；超聲波脫氣機（CH-250B 上海躍進醫療器械廠）；旋轉蒸發儀（RE-52A 上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 標樣與試劑

白藜蘆醇（色譜純，成都曼斯特生物科技有限公司）；甲醇（色譜純，天津標準科技有限公司）；乙腈（色譜純，天津標準科技有限公司）；磷酸（分析純，天津市永大化學試劑有限公司）；乙酸乙酯（分析純，天津市永大化學試劑有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）。

1.3 酒樣

瑪納斯產區2020年赤霞珠、美樂品種各自為原料做單品種發酵，采用相同釀酒輔料，不同的發酵溫度，其余工藝處理均相同。

1.4 試驗方法

1.4.1 葡萄酒樣品的處理

①直接進樣。②萃取濃縮。取20 mL葡萄酒置于分液漏斗當中，再向其中加入20 mL乙酸乙酯溶液，然后振蕩萃取15 min，再靜置分層后分液，分出有機相之后，使用無水硫酸鈉過濾，重復1次，然后將分出的有機相在50 ℃，真空旋轉蒸發至近干，用過濾過的色譜甲醇定容至5.0 mL。

1.4.2 標準曲線的制備

稱取2.0 mg白藜蘆醇標準品，配制成濃度為200 mg·L-1的白藜蘆醇10 mL儲備溶液。用白藜蘆醇標準品溶液以甲醇稀釋分別配制成1 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、8 mg·L-1、16 mg·L-1、32 mg·L-1等不同濃度的白藜蘆醇樣品溶液，每一濃度的白藜蘆醇樣品依次取20 μL進樣，按上述確定好的色譜條件測定峰面積積分值，繪制標準曲線并且得到回歸方程。

1.4.3 葡萄酒樣品的測定

酒樣溶液經孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾后，按照確定好的色譜條件上樣檢測酒樣中白藜蘆醇的含量。使用9個110 t立式自控溫發酵罐，對9個發酵罐中1#、2#、3#樣美樂發酵溫度分別設定為20 ℃、22 ℃、24 ℃；4#～9#樣赤霞珠發酵溫度分別設定為20 ℃、22 ℃、22 ℃、24 ℃、24 ℃和30 ℃；經酒精發酵結束封樣檢測結果。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

利用白藜蘆醇標準樣品進樣，觀察比較峰形并對其進行適當調整。最終，選擇的色譜柱為Shim-pack VP-ODS（4.6 mm×150.0 mm，5 μm)，流動相為乙腈：0.03%磷酸水=24∶76，流速為1 mL·min-1，306 nm為檢測波長，進樣量為20 μL，柱溫30 ℃。

2.2 白藜蘆醇標品圖譜和標準曲線的繪制

將不同梯度濃度的白藜蘆醇對照品溶液分別進樣檢測，記錄峰面積的積分值[5-6]。以白藜蘆醇標準品濃度為自變量x，測得的峰面積為因變量y，作出白藜蘆醇標的線性回歸方程為：y=21 944x-27 805，相關系數r=0.994 9，表明在所設計的濃度范圍內，白藜蘆醇峰面積與其濃度相關性顯著。

2.3 進樣方式的選擇

采用直接進樣和萃取濃縮對葡萄酒樣品溶液檢測，白藜蘆醇標準品的出峰時間為13.262 min，峰形對稱且基線平穩；葡萄酒樣品溶液中出峰A和B時間為12.962 min和12.945 min，與白藜蘆醇標準品出峰時間大致相同，因此確定其為白藜蘆醇。

對1#、2#、3#美樂樣品采用直接進樣和萃取濃縮方式進樣，圖1結果顯示，對酒樣萃取濃縮后再進樣檢測，其檢出的白藜蘆醇含量略有降低，檢測值分別降低了16.25%、8.05%和0.5%。說明在處理酒樣的過程中，白藜蘆醇因氧化或萃取不完全而造成了一定的損失[7-8]。結果顯示，樣品中白藜蘆醇在萃取濃縮處理過程中損失較大，不適宜作為紅葡萄酒中白藜蘆醇測定時的預處理的方法。雖然直接進樣法色素等雜質含量較多，易對色譜柱造成污染，使后續清洗柱子時間延長。但樣品制備簡單，后續實驗為避免白藜蘆醇在樣品處理過程中因氧化對測定結果造成影響，后續檢測都采用直接進樣法檢測。

圖1 不同酒樣處理方法測得白藜蘆醇的含量圖

2.4 酒樣測定結果

適當提高發酵溫度對赤霞珠、美樂干紅葡萄酒中白藜蘆醇溶出量的提升影響顯著[9]。由表1可知在24 ℃比20 ℃下發酵的美樂干紅白藜蘆醇含量高26.87%。由表2可知在30 ℃下比20 ℃下發酵的赤霞珠干紅白藜蘆醇的含量高239.5%，相同發酵溫度下，控溫22 ℃以上發酵，赤霞珠比美樂品種發酵過程中溶出白藜蘆醇含量高。

表1 不同發酵溫度美樂酒樣測定結果表

表2 不同發酵溫度赤霞珠酒樣測定結果表

3 討論與結論

（1）適當提高發酵溫度對提升赤霞珠、美樂干紅葡萄酒中白藜蘆醇的溶出量影響明顯。不同發酵溫度酒樣中白藜蘆醇含量測定結果顯示，不論是赤霞珠還是美樂品種，白藜蘆醇的溶出量都隨著發酵溫度的升高而提高，30 ℃比20 ℃下發酵的赤霞珠干紅白藜蘆醇含量高239.5%。24 ℃比20 ℃下發酵的美樂干紅白藜蘆醇含量高26.87%。造成這種結果的原因是葡萄果實中白藜蘆醇的溶出量隨著發酵溫度和酒精度的升高而增加。另外，在較高溫度下，所有酚類物質的浸提速度都會增加。雖然升高溫度會有利于白藜蘆醇溶出量的增加，但也不是無限升高溫度白藜蘆醇含量會持續增加。升高溫度會引起雜菌的滋生和熱敏性物質的破壞與損失，而且會導致香氣成分的遺失，酵母的高溫死亡發酵停止[10-11]，因此實際生產過程中，也不能一味地提高釀酒溫度。高溫會有過多酚類物質的浸提，香氣成分遺失，釀酒師應在實際生產中根據生產成本，結合葡萄酒感官指標要求以及產品風格予以合理控制，以獲得風味優良且白藜蘆醇含量較高的紅葡萄酒產品。

（2）瑪納斯產區赤霞珠比美樂品種釀出的葡萄酒中白藜蘆醇含量高。表1和表2的檢出結果看，隨著發酵溫度設定的提高，相同發酵溫度下，瑪納斯產區赤霞珠葡萄品種釀出的葡萄酒中白藜蘆醇含量高于美樂干紅葡萄酒。

（3）葡萄產地的氣候條件和土壤環境，直接影響著葡萄酒中白藜蘆醇含量。我國的西部地區光照時長、充足，有利于葡萄的生長發育，漿果顏色深，成熟度好；晝夜溫差大，有利于葡萄的糖分積累，含糖量高；冬季寒冷，葡萄病害不易隔代傳播。而這些因素導致西北地區較高與東部產區葡萄白藜蘆醇含量[12]。然而，本次研究當年春季葡萄萌芽期遭受了霜凍，葡萄的成熟度相對較差，檢測白藜蘆醇的含量數據較低。從表2結果中看，6#、8#酒樣葡萄園土質情況為黏土層且土層較厚，5#、7#酒樣葡萄園土質情況為沙土礫石且土層較薄。相同發酵溫度下，22℃時6#酒樣比5#酒樣中檢測出的白藜蘆醇含量低2.6%，24℃時8#酒樣較7#酒樣檢測出的白藜蘆醇含低9.6%，上述情況說明葡萄產地的氣候條件和土壤環境，直接影響著葡萄酒中白藜蘆醇含量[13-14]。