miR-196a2和miR-499基因多態性與云南漢族人群非小細胞肺癌的相關性*

楊佳， 馬千里， 李盈甫， 王瑩瑩， 李傳印， 洪超， 朱小永， 肖云， 譚芳**

(1.中國醫學科學院 & 北京協和醫學院 醫學生物學研究所， 云南 昆明 650118； 2.昆明醫科大學第三附屬醫院 胸外科， 云南 昆明 650118； 3.昆明醫科大學第一附屬醫院 干療科， 云南 昆明 650032； 4.昆明醫科大學 基礎醫學院， 云南 昆明 650500； 5.昆明醫科大學第三附屬醫院 重癥醫學科， 云南 昆明 650118)

近年來隨著癌癥發病率和死亡率不斷升高，現已成為一個重要的公共健康問題[1]。肺癌作為全球范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，在中國的發病率和死亡率也很高，且呈逐年上升趨勢[1-2]。研究表明，吸煙是肺癌發生的最重要風險因素[3-4]，但只有15%的吸煙者可能會罹患肺癌，這說明其他因素在肺癌的發生中也發揮著重要的作用[5]，尤其是個體遺傳因素[6]。微RNA(miRNAs)是一類單鏈非編碼小RNA分子，長度為21～24個核苷酸。miRNAs在真核細胞生物學過程中發揮重要的調控功能，超過60%的人類基因組蛋白編碼基因的表達可能會受到miRNAs的調控[7]。人類基因組編碼的miRNA分子在不同組織中的特異性表達，在胚胎發育、維持組織和器官正常生理功能中發揮重要作用[8]，在肺癌等大多數的人類腫瘤中均發現了miRNA基因的異常表達[9]。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNPs)是人類基因組中常見的遺傳變異，而miRNA基因編碼區域的SNPs可能會對miRNA表達及生物學活性產生影響，與多種人類疾病的易感性相關[10]，在對肺癌的研究中，發現了大量與肺癌易感性相關的miRNA基因SNPs位點[11-12]。由于不同研究納入的人群和樣本量的不同，不同相關性研究結果存在不一致的情況，比如2009年Tian等[13]的研究顯示，miR-196a2基因的SNPs 位點rs11614913的基因型CC可能會增加肺癌的患病風險；但在2019年Mohamed等[14]則發現該位點基因型CC可能是肺癌發生的保護性因素。因此，為研究miRNA基因中的SNPs與云南漢族人群NSCLC的相關性，本研究選取了miR-196a2和miR-499基因的SNPs位點rs11614913和rs3746444，調查這2個SNPs位點在云南漢族人群NSCLC患者及健康人群中的分布特征，并分析這2個SNPs位點與云南漢族人群NSCLC易感性的關系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1對象及分組 選取2015年10月—2018年5月確診的415例NSCLC的患者作為病例組，根據世界衛生組織肺癌組織類型劃分標準，病例組按病理類型分為鱗癌、腺癌、鱗腺癌及其他類型肺癌；另外，采用國際肺癌臨床分期系統進行臨床分期，病例組臨床分期分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ期。病例組納入標準為：所有病例均為初次確診未接受放化療等抗腫瘤治療、未患有其他惡性腫瘤、無其他慢性疾病。選取同期體檢的健康個體462例為對照組，對照組的納入標準為：影像學檢查未發現肺部占位性病變、無刺激性干咳、血痰、胸痛等癥狀、未患有其他惡性腫瘤、無其他慢性疾病。所有研究對象均為居住于云南、彼此無血緣關系的漢族個體，年齡23～88 歲。

1.1.2主要試劑和儀器 QIAamp全血基因組 DNA 提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，QIAGENE公司，德國)，基因分型試劑(TaqMan Genotyping Master Mix，ABI公司，美國)，TaqMan探針分型試劑盒(rs11614913探針試劑盒編號為C___731185852_10和rs3746444探針試劑盒編號為C__2142612_40，ABI公司，美國)，ND-2000微量紫外可見分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，QuantStudio 6實時熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 采集空腹靜脈血5 mL，用EDTA·K2或肝素抗凝，使用全血基因組DNA提取試劑盒提取 DNA。用超微量紫外可見分光光度計檢測DNA的濃度和純度。

1.2.2基因分型 本研究采用TaqMan探針基因分型法對miR-196a2基因SNPs位點rs11614913和miR-499基因SNPs位點rs3746444進行基因分型。基因分型PCR反應體積為5 μL，包含SNPs分型試劑2.5 μL、TaqMan探針(20×)0.25 μL、樣品DNA 1 μL、雙蒸水1.25 μL。反應程序為95 ℃ 預變性10 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火延伸1 min，共40個循環。每次實驗均設置陰性對照(以雙蒸水代替DNA模板樣本)。使用基因分型軟件TaqMan Genotyper Software進行結果分析。同時，每個位點選取3個不同基因型的樣本進行測序驗證。

1.3 統計學分析

使用SPSS 19.0軟件進行數據的統計分析，采用t檢驗分析病例組和對照組年齡差異，用χ2檢驗分析病例組和對照組性別差異；PLINK軟件計算病例組和對照組中每個SNPs位點的基因型、等位基因頻率，哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinbergequilibrium，HWE)評價2組隨機樣本的群體代表性；使用χ2檢驗分析病例組和對照組間等位基因和基因型頻率的分布差異，使用在線軟件SNPStats對2個SNPs位點的5種遺傳模式進行分析[包括共顯性模式(codominant)、顯性模式(dominant)、隱性模式(recessive)、超顯性模式(overdominant)和邏輯加性模式(log-additive)]，根據赤池信息量準則(akaikeinformationcriterion，AIC) 和貝葉斯信息準則(bayesianinformationcriterions，BIC) 的數值來確定每個位點的最優遺傳模式，即AIC和BIC數值最小的遺傳模式為最優的遺傳模式。以P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的基本特征

本研究共納入NSCLC患者415例，平均年齡(55.84±10.70)歲，其中男290例、女125例，按病理類型分為鱗癌患者150例、腺癌患者241例、鱗腺癌及其他類型肺癌患者24例，按臨床分期Ⅰ+Ⅱ期患者134例、Ⅲ+Ⅳ期患者281例。對照組462例，平均年齡(5.56±6.75)歲，其中男315例、女147例。病例組和對照組的年齡和性別分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 rs11614913和rs3746444位點等位基因、基因型與NSCLC的相關性

結果顯示，rs11614913和rs3746444位點的基因型在病例組和對照組中的分布均符合HWE定律(P>0.05)，說明本研究的樣本是具有群體代表性的隨機樣本。對2個SNPs位點的等位基因和基因型頻率在病例組和對照組中分布特征進行分析后發現， rs11614913和rs3746444位點的等位基因和基因型在病例組和對照組中分布頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 rs11614913和rs3746444位點的等位基因和基因型在病例組和對照組的分布

2.3 遺傳模式分析miR-196a2和miR-499基因2個SNPs位點與NSCLC的相關性

miR-196a2和miR-499基因2個SNPs位點與NSCLC的相關性分析結果顯示，對病例組和對照組的rs11614913和rs3746444的最優遺傳模式均為超顯性遺傳模式。在超顯性遺傳模式中，2個SNPs位點在病例組和對照組中分布頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 病例組與對照組SNPs位點rs11614913和rs3746444的遺傳模式分析

2.4 rs11614913和rs3746444位點與NSCLC病理類型和臨床分期的相關性

結果顯示，miR-196a2基因SNPs位點rs11614913和miR-499基因SNPs位點rs3467444可能與NSCLC的病理類型具有相關性，其中rs11614913等位基因C攜帶者患NSCLC腺癌的風險更高(OR=1.388，95%CI為1.038～1.857，P=0.027)，而rs3467444等位基因G的攜帶者可能更容易患NSCLC鱗癌(OR=9.713，95%CI為4.054～23.269，P<0.001)。見表3。

表3 SNPs位點rs11614913和rs3746444與NSCLC病理類型和臨床分期的關系

3 討論

有學者認為，腫瘤組織中miRNA的表達異常是腫瘤發生發展的重要因素之一[15]，而miRNA基因中的SNPs位點可能是影響miRNA表達的因素之一[16]。因此，miRNA基因中的SNPs可能是通過影響miRNA基因的表達而在腫瘤發生發展過程中發揮作用。

研究發現，miR-196a2在肺癌組織中的表達水平明顯高于正常肺組織[17]。rs11614913是一個位于miR-196a2基因成熟序列的變異位點，該SNPs位點可能與成熟miR-196a2的表達水平相關。近年來，該SNPs位點與腫瘤發生風險的相關性被廣泛研究[18-19]，其中有些研究發現該位點基因型CC可能與肺癌風險增加相關[7, 20]，而有些研究提示該位點基因型CC可能是肺癌發生的保護性因素[14]，也有些研究并未發現該位點與肺癌的相關性[21]。本研究結果表明該位點與云南漢族人群NSCLC易感性無關，但分層分析結果顯示，該位點可能與NSCLC的病理類型相關。以上研究表明miR-196a2基因中的多態性位點rs11614913與肺癌風險相關性的結果存在不一致，這可能是由于不同研究所選的人群遺傳背景以及不同研究納入的樣本量大小不一致造成的。因此，未來仍需要開展更多大樣本量的相關性研究以及功能研究，以確定該SNPs位點與肺癌風險的相關性。

研究還發現，miR-499在多種人類腫瘤中發揮抑癌基因的作用[22-22]，可作為腫瘤治療候選靶標[23]。在肺癌中的研究也發現，miR-499在肺癌發生中發揮抑癌基因作用[24]，且可作為肺癌診斷和預后的標記分子[25]，miR-499基因中的SNPs位點rs3746444不同基因型與成熟miR-499的表達水平有關[26]，這可能是該SNPs位點與腫瘤發生風險相關的原因之一[27]。在肺癌的相關性研究中，Li等[28]的研究顯示，rs3746444等位基因C可能是肺癌發生的風險因素。但Vinci和Fan等[17, 29]的研究并未發現該位點與肺癌的相關性。同樣，本研究結果也未發現rs3746444與云南漢族人群NSCLC風險具有相關性(P>0.05)，但在分層分析中，發現該位點可能與NSCLC的病理類型具有相關性。

綜上所述，本研究雖未發現miR-196a2基因SNPs位點rs11614913和miR-499基因SNPs位點rs3467444與云南漢族人群NSCLC風險具有相關性，但可能與NSCLC病理類型相關。