苗藥赤脛散乙酸乙酯部位的化學成分分離及鑒定*

王彬宇， 黃家宇， 杜秋瑩， 陳思憶， 陳菊， 魯婷婷， 李莉*

(貴州醫科大學 藥學院， 貴州 貴陽 550025)

苗藥赤脛散(PolygonumruncinatumBuch.- Ham. Var. sinense Hemsl.)為蓼科蓼屬植物赤脛散的干燥根莖，別名花蝴蝶、血當歸等，其性寒、味苦、澀、性平及無毒，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》2003年版，是西南苗族地區常用藥[1-2]。苗藥赤脛散主要分布于貴州、云南及湖北等地，民間常用于治療腹痛、痢疾、急性胃腸炎、吐血咯血、痔瘡出血、赤白帶下、月經不調及跌打損傷等，外用治療乳腺炎和癰癤腫毒[3]。目前文獻對赤脛散的化學成分報道較少，主要集中在揮發油和鞣花酸類成分的研究[4-7]?，F代藥學研究證明，赤脛散提取物具有良好的抑菌作用[8]，本課題組前期對其體外抑菌活性部位進行篩選，發現乙酸乙酯萃取部最優[9]。為進一步明確其藥效物質基礎，本實驗對赤脛散藥材乙酸乙酯部的化學成分進行系統研究，分離并鑒定其中的化合物，現將結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥材來源 赤脛散藥材產自貴州省貴陽市開陽縣城關鎮，經貴州醫科大學藥學院生藥學教研室龍慶德副教授鑒定為蓼科蓼屬植物赤脛散的干燥根。

1.1.2主要儀器與試劑 超導核磁共振波譜儀(德國BRUKER)，TSQ Quantum三重四極桿液質聯用儀(美國Thermo Finnigan)，Sephadex LH-20(美國GE Healthcare)；厚制備板(煙臺江友硅膠開發有限公司)，GF254硅膠薄層板、硅膠(80-100目、200-300目)購自青島海洋化工有限公司；氘代甲醇和氘代吡啶(中國薩恩化學)，氘代氯仿(上海泰坦)；有機試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1赤脛散乙酸乙酯部位的提取 取赤脛散干燥根15 kg，粉碎成粗粉后用10倍量95%乙醇浸泡過夜，加熱回流提取3次、3 h/次，合并提取液，濃縮后得到總浸膏；加水分散，用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇依次萃取，濃縮得石油醚部位6.4 g、乙酸乙酯部位1.6 kg及正丁醇部位2.1 kg。

1.2.2乙酸乙酯部位初步分離 取乙酸乙酯部位樣品380.7 g，加入適量二氯甲烷-甲醇混合溶劑進行溶解，取80～100目硅膠適量，于恒溫水浴鍋上拌樣(50 ℃)，至溶劑揮干，無明顯顆粒感；取200～300目硅膠，采用濕法裝柱，干法上樣，然后用二氯甲烷-甲醇=(1 ∶0～0 ∶1)進行梯度洗脫，采用錐形瓶收集流份，通過薄層色譜法點樣、展開、紫外燈下觀察，合并相似的組分并進行編號，得到Fr.1～Fr.7。

1.2.3樣品Fr.1-Fr.5分離與純化 Fr.1重結晶得化合物1(493.0 mg)，經石油醚-乙酸乙酯(80 ∶1)硅膠柱層析得化合物3(594.7 mg)；Fr.2經二氯甲烷-甲醇(80 ∶1)硅膠柱層析、Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝膠柱層析得化合物2(126.2 mg)；Fr.3經二氯甲烷-甲醇(50 ∶1)硅膠柱層析、Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝膠柱層析得化合物9(42.3 mg)；Fr.4經二氯甲烷-甲醇(30 ∶1～0 ∶1)硅膠柱梯度洗脫得6個組分(Fr.4-1～Fr.4-6)，Fr.4-1經Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝膠柱層析、制備薄層(乙酸乙酯 ∶丙酮=5 ∶1)層析得化合物4(10.8 mg)、化合物5(17.9mg)；Fr.4-2經Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝膠柱層析得化合物6(23.0 mg)；Fr.5經二氯甲烷-甲醇(15 ∶1～0 ∶1)硅膠柱層析、Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝膠柱層析得化合物7(11.7 mg)、化合物8(185.6 mg)。

2 結果

2.1 化合物1

白色片狀結晶，C29H50O；ESI-MSm/z為437.36 [M+Na]+；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ為3.49～3.57(1H，m，H-3)、5.32～5.36(1H，m，H-6)、0.68(3H，s，H-18)、1.01(3H，s，H-19)、0.92(3H，d，J=6.4 Hz，H-21)及0.81～0.86(9H，ovelap，H-26,27,29)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ為37.26(C-1)、29.71(C-2)、71.83(C-3)、42.33(C-4)、140.77(C-5)、121.74(C-6)、31.92(C-7)、31.67(C-8)、50.14(C-9)、36.52(C-10)、21.10(C-11)、39.78(C-12)、42.31(C-13)、56.78(C-14)、24.32(C-15)、28.26(C-16)、56.06(C-17)、11.87(C-18)、19.41(C-19)、36.16(C-20)、18.79(C-21)、33.95(C-22)、26.07(C-23)、45.84(C-24)、29.16(C-25)、19.83(C-26)、19.04(C-27)、23.07(C-28)及11.99(C-29)。鑒定為β-谷甾醇。

2.2 化合物2

淡黃色粉末，C17H12O8；ESI-MSm/z為343.07 [M-H]-；1H NMR (600 MHz, Pyr)δ為7.84(1H，s，H-5)、8.06(1H，s，H-5′)、4.17(3H，s，3-OCH3)、4.22(3H，s，3′-OCH3)、3.88(3H，s，4′-OCH3)；13C NMR (150 MHz, Pyr)δ為111.61(C-1)、141.78(C-2)、141.14(C-3)、154.08(C- 4)、112.60(C-5)、112.90(C-6)、158.93(C-7)、113.60(C-1′)、142.11(C-2′)、141.51(C-3′)、154.31(C-4′)、107.85(C-5′)、114.08(C-6′)、159.03(C-7′)、61.10(3-OCH3)、61.34(3′-OCH3)及56.37(4′-OCH3)。鑒定為3,3′,4 ′-三甲基鞣花酸。

2.3 化合物3

淡黃色油狀物，C16H22O4；ESI-MSm/z為279.12 [M+H]+和301.11[M+ Na]+；1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ為7.68～7.71(2H，m，H-2,5)、7.46～7.49(2H，m，H-3,4)、4.29(2H，t，J=6.8 Hz，H-1′)、1.66～1.73(2H，m，H-2′)、1.37～1.45(2H，m，H-3′)、0.92(3H，t，J=7.6 Hz，H-4′)、4.08(2H，d，J=6.4 Hz，H-1″)、1.99～2.05(1H，m，H-2″)，0.97(6H，d，J=6.8 Hz，H-3″,H-4″)；13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ為132.29(C-1,C-6)、130.74(C-2,C-5)、128.66(C-3,C-4)、167.32 (C-7,C-8)、65.20(C-1′)、30.46(C-2′)、18.97(C-3′)、13.54(C-4′)、71.46(C-1″)、27.60 (C-2″)及19.05(C-3″,C-4″)。鑒定為鄰苯二甲酸正丁酯異丁酯。

2.4 化合物4

白色粉末，C8H8O4；ESI-MSm/z為167.02[M-H]-；1H NMR (600 MHz, MeOD)δ為7.55(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)、6.71(1H，d，J=7.8 Hz，H-5)、7.46(1H，dd，J=7.8,1.8 Hz，H-6)及3.86(3H，s，3-OCH3)；13C NMR (150 MHz, MeOD)δ為128.07(C-1)、112.56(C-2)、147.16(C-3)、150.38(C-4)、114.25(C-5)、122.97(C-6)、174.49(C-7)及54.82(3-OCH3)。鑒定為香草酸。

2.5 化合物5

白色針狀結晶，C9H10O5；ESI-MSm/z為197.05[M-H]-；1H NMR (600 MHz, MeOD)δ為7.33(2H，s，H-2,6)和3.88(6H，s，2×OCH3)；13C NMR (150 MHz, MeOD)δ為120.64(C-1)、106.91(C-2,6)、147.42(C-3,5)、140.29(C-4)、168.66(C-7)及55.37(2×OCH3)。鑒定為丁香酸。

2.6 化合物6

白色針狀結晶，C7H6O3；ESI-MSm/z為137.07[M-H]-；1H NMR (400 MHz, MeOD)δ為7.90(2H，d，J=8.8 Hz，H-2,6)和6.84(2H，d，J=8.8 Hz，H-3,5)；13C NMR (100 MHz, MeOD)δ為121.41(C-1)、114.64(C-2,6)、131.61(C-3,5)、161.93 (C-4)及168.82(C-7)。鑒定為對羥基苯甲酸。

2.7 化合物7

淡黃色粉末，C7H6O4；ESI-MSm/z為153.01[M-H]-；1H NMR (400 MHz, MeOD)δ為7.43～7.46(2H，m，H-2,6)和6.82(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)；13C NMR (100 MHz, MeOD)δ為121.78(C-1)、116.32(C-2)、144.66(C-3)、150.11(C-4)、114.35(C-5)、122.48(C-6)及168.90(C-7)。鑒定為原兒茶酸。

2.8 化合物8

無色針狀結晶，C7H6O5；ESI-MSm/z為169.11[M-H]-；1H NMR (400 MHz, MeOD)δ為7.08(2H，s，H-2,6)；13C NMR (100 MHz, MeOD)δ為120.55(C-1)、108.92(C-2,6)、144.99(C-3,5)、138.20(C-4)及169.00(C-7)。鑒定為沒食子酸。

2.9 化合物9

白色粉末，C9H10O5；ESI-MSm/z為197.03[M-H]-；1H NMR (600 MHz, MeOD)δ為7.05(2H，s，H-2,6)，4.27(2H，q，J=7.2 Hz，H-8)，1.34(3H，t，J=7.2 Hz，H-9)；13C NMR (150 MHz, MeOD)δ為120.37(C-1)，108.61(C-2,6)，145.08(C-3,5)，138.30(C-4)，167.18(C-7)，60.29(C-8)，13.25(C-9)。鑒定為沒食子酸乙酯。

3 討論

本研究從苗藥赤脛散乙酸乙酯部位中分離鑒定了9個化合物，將分離化合物的波譜數據與國內外文獻[5,10-21]進行比對，再通過質譜與化合物理化性質進一步分析，最終確定化合物1～9的結構歸屬。其中化合物3(鄰苯二甲酸正丁酯異丁酯)、化合物4(香草酸)、化合物5(丁香酸)、化合物6(對羥基苯甲酸)及化合物7(原兒茶酸)等5個化合物為首次在該植物中分離得到，進一步完善了苗藥赤脛散的化學成分信息，為其藥效物質基礎研究奠定了一定的理論基礎，為赤脛散資源開發提供了實驗依據。

本實驗前期使用混合有機溶劑溶解樣品，采用石油醚-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、石油醚-丙酮、三氯甲烷-甲醇分別作為展開劑進行薄層色譜分析，結果表明二氯甲烷-甲醇和三氯甲烷-甲醇的分離效果較好，具有良好的成點性，因三氯甲烷對光敏感，在光照下易被氧化生成劇毒光氣且屬于易制毒管制化學品，故選擇二氯甲烷-甲醇作為赤脛散乙酸乙酯部位初步分離的洗脫劑。初步分段后根據各組分樣品的極性大小和分離效果再進行洗脫劑的選擇。

由于乙酸乙酯萃取部位的化合物為中大極性，故采用正相硅膠和葡聚糖凝膠 LH-20交替使用，通過反復柱層析使分離效果得到提高。經初步分離后Fr.1組分中觀察到大量固體，重結晶后即得到化合物1，剩余母液中存在較多雜質，通過薄層色譜分析后采用石油醚-乙酸乙酯系統進行梯度硅膠柱層析，再通過反復凝膠純化得到化合物3。因化合物4和化合物5極性相似、分子量大小相近，硅膠柱層析及凝膠均無法使其完全分離且樣品量較少，嘗試多種混合有機溶劑后最終選用乙酸乙酯-丙酮作為展開劑，通過厚制備薄層層析板進行分離與純化。其余化合物大都經不同比例的二氯甲烷-甲醇系統通過正相硅膠柱多次梯度洗脫，再由葡聚糖凝膠 LH-20純化得到。

在單體確定的過程中，使用多種不同極性的混合展開劑分別展開，在紫外燈下進行觀察。同時，借助碘、10%硫酸乙醇等廣譜顯色劑及高效液相色譜等手段進行綜合判斷分析。最后，通過波譜與質譜等技術進行結構鑒定。

本實驗首次在該植物中分離得到的香草酸(4)、丁香酸(5)、對羥基苯甲酸(6)及原兒茶酸(7)已被證實具有抗菌、抗病毒及抗氧化等藥理作用[22-24]，為苗藥赤脛散的抑菌活性物質，但當前對于酚酸類化合物的抗菌機制尚未完全明確[25]，有待深入研究。