探討錫林郭勒盟地區(qū)新生兒先天性耳聾基因的突變類型

王晶 姜曉洪 劉艷 劉歡

先天性耳聾是嬰兒出生時因基因遺傳及環(huán)境因素(如創(chuàng)傷、醫(yī)療、藥物等)造成的聽力感覺障礙缺陷,約占我國新生兒出生總數(shù)的0.15%［1］。據(jù)統(tǒng)計,遺傳性基因突變因素約占總因素的60%,目前世界上已確定的與出生相關(guān)的耳聾基因突變64 個,突變位點125 個［2］,在我國,常見的耳聾基因突變包括GJB2、線粒體基因等,基因突變會造成新生兒聽力不同程度的異常,如高頻音域、重度感音等的不敏感［3］。在嬰兒出生時即對耳聾進行篩查,對先天性耳聾的早期診斷和干預(yù)意義重大。而臨床發(fā)現(xiàn),先天性耳聾具有癥狀遲發(fā)的特點,即出生早期表現(xiàn)不出來,而在其后的生長發(fā)育期間逐漸顯露,因此,單純依靠純音測聽儀器進行聽力檢測無法真實的檢測出全部先天性耳聾情況［4］；且純音聽力測試需要推遲到新生兒出生后3 個月進行復(fù)查,才能最終確診,前后共需要最多達到6個月時間。采用基因檢測對致病位點進行基因分析,是現(xiàn)階段先天性耳聾篩查的重要擴展手段,能彌補純音檢查的局限性,減少假陰率,且具有簡單快捷、準確率高的特點。本研究對錫林郭勒盟地區(qū)的新生兒進行了基因篩查,以探討耳聾基因的篩查結(jié)果及篩查方法的應(yīng)用,并了解耳聾基因在不同地區(qū)的基因分布特征,以作為先天性耳聾發(fā)現(xiàn)和干預(yù)的臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟地區(qū)2018～2019 年新出生的592 例新生兒作為研究對象,其中男304 例,女288 例；胎齡32～40 周,平均胎齡(38.2±5.5)周；出生體重2.5～4.6 kg,平均出生體重(3.2±0.8)kg；順產(chǎn)256 例,剖宮產(chǎn)336 例。新生兒家屬均在充分了解基因篩查的基礎(chǔ)上簽署同意書。納入標準：①新生兒臨床資料完整；②新生兒家屬同意本次研究。排除標準：①新生兒在母胎孕期異常；②早產(chǎn)兒；③智障患兒；④出生時合并腦膜炎或中耳炎；⑤其他遺傳性疾病。

1.2方法

1.2.1工具與材料 使用全血核酸提取試劑盒對所有新生兒DNA 進行提取,用耳聾基因檢測試劑盒和核酸分子雜交儀對新生兒突變基因進行檢測,使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增儀作為輔助［5］。

1.2.2DNA 的提取和基因檢測 在新生兒出生3 d 內(nèi)采集期靜脈血3 ml,送至實驗室,經(jīng)試劑盒提取DNA后監(jiān)測DNA 質(zhì)量濃度、DNA 純度,方法可以采用紫外分光光度法,確保濃度≥200 ng/L,純度A260 與A280比值范圍為1.8～2.0。將提取后的DNA 冷藏備用,采用PCR+導(dǎo)流雜交法,依照耳聾基因易感測試盒的操作說明,測試耳聾基因常見的13 個突變點。PCR 增擴：取適量PCR 增擴引物混合物與PCR 增擴試劑混合物,經(jīng)過：10 min 37 ℃,15 min 95℃,1 min 96℃,30 s 94℃,30 s 55 ℃,45 s 70℃,總共經(jīng)歷32 個循環(huán),最后以10 min 60℃處理后在4℃下保存。雜交過程：事前將雜交儀以雜交程序預(yù)熱30 min 以上,溫度設(shè)定為50℃。將增擴后的PCR 產(chǎn)物給以5 min 95℃變性之后冰浴冷卻3 min,從增擴管中取PCR 產(chǎn)物與雜交緩沖液混合并經(jīng)瞬時離心,將低密度芯片探針與混合液雜交,通過顯色反應(yīng),得到最終結(jié)果。

1.3質(zhì)量控制 參考國家標準GB/T 27043-2012/ISO/IEC 17043：2010 合格評定能力［6］驗證通用要求執(zhí)行。

1.4觀察指標 分析錫林郭勒盟地區(qū)新生兒基因攜帶情況分析及其分布情況。統(tǒng)計我國人種中常見的4 種耳聾易感基因和13 個常見突變位點,包括：①GJB2基因,熱點突變位點為35delG、176del16、235delC、299delAT、155delTCTG；②SLC26A4 基因,熱點突變位點為IVS7-2A＞G、2168A＞G、1229C＞T；③GBJ3 基因,熱點突變位點為538C＞T；④線粒體12Sr RNA 基因,熱點突變點為1494C＞T、1555A＞G、7445A＞G、12201T＞C。

2 結(jié)果

2.1新生兒耳聾基因攜帶情況分析 592 例新生兒中共發(fā)現(xiàn)耳聾基因攜帶者32 例,占比為5.41%；突變基因中GJB2 基因14 例,占總例數(shù)的2.36%；SLC26A4基因10 例,占總例數(shù)的1.69%；GJB3 基因4 例,占總例數(shù)的0.68%；線粒體12SrRNA 基因4 例,占總例數(shù)的0.68%。見表1。

表1 新生兒耳聾基因攜帶情況分析 (n,%)

2.2新生兒基因位點分布情況 新生兒檢出最多的突變位點是GJB2 的235delC 和SLC26A4 的IVS7-2A＞G突變,分別占總例數(shù)的1.18%(7/592)和0.84%(5/592),其余依次為GJB2 的176del16 雜合突變和GBJ3 的538C＞T 雜合突變,均占總例數(shù)的0.68%(4/592)。

3 討論

先天性耳聾是新生兒出生缺陷的一種,遺傳因素在先天性耳聾原因中占有相當大的比例,因此遺傳性耳聾越來越受到國內(nèi)外學(xué)術(shù)研究的重視,先天性耳聾篩選的基因檢測工作也逐漸展開。通過比對目前國際上已發(fā)現(xiàn)的耳聾基因,從而可以掌握新生兒基因的突變情況,并以此斷定新生兒是否患有先天性耳聾。

新生兒先天性耳聾基因因地域及人種不同而不同,有研究指出,中國新生兒遺傳性耳聾主要與GJB2、SLC26A4、GJB3 及線粒體基因相關(guān),但各地區(qū)報道的新生兒基因突變比例有較大差異［7］。方炳雄等［8］的研究中對粵東地區(qū)1430 例新生兒展開耳聾基因突變調(diào)查,發(fā)現(xiàn)陽性檢出率為3.85%。楊曉等［9］在西北地區(qū)新生兒遺傳性耳聾篩查中發(fā)現(xiàn),751 例中出現(xiàn)基因突變39 例,陽性檢出率為5.18%。本次研究中,在對592 例新生兒耳聾篩查中發(fā)現(xiàn)基因突變新生兒32 例,占比為5.41%,與西北地區(qū)調(diào)查較為接近,而檢出率高于粵東地區(qū),這顯示出遺傳性耳聾基因突變的地域相關(guān)性。

本次研究中4 種基因突變率與前述研究有一定的差別,同樣體現(xiàn)了基因突變的地域性。GJB2 的突變不會導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損害,患者聽覺相關(guān)神經(jīng)中樞完整,但GJB2 基因突變能引起連接蛋白異常,進而影響細胞間隙,對聽覺的影響程度與突變位點相關(guān)［10］,235delC雜合突變是常見的截斷性突變,在本次研究中發(fā)生率為1.18%,能造成新生兒重度、極重度感音性耳聾。盡管耳聾基因的攜帶對于新生兒認知、閱讀能力的提高沒有直接關(guān)系,但聽力障礙會極大的影響兒童語言學(xué)習(xí)、交流能力的培養(yǎng),如果不進行有效干預(yù),新生兒極有可能發(fā)展成為聾啞人,造成終生遺憾。盡管后天的教育能夠彌補耳聾帶來的缺憾,但該問題的終極解決方案仍在于盡早診斷和發(fā)現(xiàn)患兒攜帶耳聾基因,并提前做好準備,在發(fā)現(xiàn)患兒聽力下降后,幫助其安裝人工耳蝸恢復(fù)其聽力,才不會錯過生長發(fā)育階段而造成終生缺憾。

SLC26A4 基因較為常見的突變位點是IVS7-2A＞G,在本例研究中共發(fā)現(xiàn)5 例,發(fā)生率為0.84%,該位點的突變能造成新生兒遲發(fā)性非綜合耳聾,患兒在出生時表現(xiàn)出聽力正常,但在隨后的生長發(fā)育過程中因創(chuàng)傷、碰撞、驚嚇、噪音等因素會出現(xiàn)聽力突然下降,俗稱“一巴掌致聾”。對這部分致聾患者應(yīng)提高告知耳聾的風險,生活中避免劇烈活動,防止腦外傷形成,延緩耳聾的發(fā)生。如聽力突然下降,則有可能是該基因致病,可佩帶助聽器獲得適量的聽力補償,或安裝人工耳蝸助其恢復(fù)聽力。GJB3 基因突變攜帶者也屬于遲發(fā)性耳聾,患兒青少年時期聽力正常,但到青壯年時期出現(xiàn)聽力明顯下降,主要體現(xiàn)在對高頻感音的不敏感。本次研究中檢測出4 例線粒體12S rRNA 基因的1555A＞G 位點均質(zhì)突變和雜合突變,該基因攜帶者與患兒出現(xiàn)遲發(fā)性或藥物性耳聾相關(guān),該類型的攜帶者需要注意抗生素的使用,因為可能引起患兒出現(xiàn)藥物致病耳聾。

相比單純的聽力篩查,耳聾基因檢測有其優(yōu)越性,其除了能篩查出先天性耳聾患兒,更為重要的是能篩查出遲發(fā)性及藥物敏感性耳聾基因攜帶者,這是純音聽力檢查無法檢測出的。但同時耳聾基因檢測也有其弱勢,即檢測不出創(chuàng)傷性、化學(xué)藥物性、醫(yī)療或妊娠引起的非遺傳性耳聾,因此耳聾基因檢測必須與純音聽力篩查同步進行,互為補充,盡早發(fā)現(xiàn)潛在的耳聾新生兒,并及時向其父母展開健康宣教,減少新生兒在生長發(fā)育過程中耳聾的發(fā)生及由耳聾帶來的負面影響,并盡早開展人工耳蝸等輔助措施,助其獲得正常聽力?；驒z測的意義不僅在于篩選出攜帶耳聾基因的患者,更在于基于父母的基因類型,推斷出其后代攜帶耳聾基因的幾率,從而對家庭的婚育起到指導(dǎo)作用,避免攜帶耳聾基因新生兒的出生。對于有耳聾家族史或本身已患耳聾的育齡夫婦應(yīng)該重點接受耳聾基因的檢測,以盡早對于后代攜帶有耳聾基因做好準備。對于同種類型耳聾基因攜帶的妊娠期夫婦進行產(chǎn)前耳聾基因檢測非常有必要,可以提早識別出胎兒是否攜帶耳聾基因,并據(jù)此作出是否終止妊娠的決定。

綜上所述,耳聾基因檢測是新生兒耳聾篩查的重要工具,能篩查出遲發(fā)性耳聾患兒基因攜帶者,是早期發(fā)現(xiàn)患兒聽力障礙的重要補充。對新生兒進行基因檢測和篩查,能夠盡早發(fā)現(xiàn)耳聾突變基因攜帶者,早診斷、早干預(yù),明確病因、合理用藥治療,從而減少耳聾的發(fā)生。