VSTM2A、MICA基因多態性與宮頸癌發病風險的關聯性

許冰霜 魯 希 李東豫

宮頸癌為女性第二大常見腫瘤類型。國內外對宮頸癌遺傳背景[1]的研究多集中在基因多態性。單核苷酸多態性(single-nucleotide polymorphisms，SNP) 為基因組中范圍最廣的變異類型，體現了個體差異DNA序列最基本變化形式，人體中90%以上的DNA變異和SNP有關[2]。V-組跨膜結構域包含物2A(V-set and transmembrane domain containing 2A，VSTM2A)蛋白由前脂肪細胞分泌，在大腦、前列腺、睪丸、胃、結腸、小腸、腎上腺、神經中呈現高表達，在子宮中表達極低[3]。主要組織相容性復合體Ⅰ類相關基因A(major histocompatibility complex classⅠchain-related geneA,MICA)位于HLA-B基因位點上游，具高度多態性，與多種腫瘤類型如胃癌、皮膚癌等有關[4]。本研究對VSTM2A、MICA基因多態性進行檢測，探討其與宮頸癌發病風險的關聯性，為宮頸癌的早期診斷提供基因學證據，報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院2019年1月至2020年4月收治的105例宮頸癌患者(病例組)以及105例正常健康者(對照組)。病例組患者均經宮頸多點活檢病理或手術病理證實為宮頸癌，病灶原發于宮頸，于本院就診，無合并其他癌癥，既往未接受過放療或者化療，明確病理類型、臨床分期、淋巴結轉移等，年齡31～78歲，平均(59.60±10.28)歲；孕次0～6次，平均(2.80±0.61)次；產次0～4次，平均(2.06±0.50)次。對照組女性，有性生活史，無腫瘤病史和臨床體征，已行子宮頸癌篩查排外宮頸癌，年齡30～79歲，平均(59.71±10.30)歲；孕次0～6次，平均(2.79±0.57)次；產次0～4次，平均(2.09±0.49)次。病例組與對照組年齡、孕次、產次比較，未見明顯差異(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采集所有研究對象外周靜脈血3 ml，EDTA抗凝，混勻后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 基因組DNA提取 使用貝克曼AMPurea XPDNA血液基因組提取試劑盒進行血液樣本基因組提取，嚴格按照說明書操作，提取后，檢測樣本純度，合格后保存于-70 ℃保存待用。

1.2.3 引物設計 針對VSTM2A基因的rs7457728 SNP位點，MICA基因的rs2516448 SNP位點，美國Sequenom公司設計引物，引物合成由上海生物工程技術服務有限公司負責。引物序列：①rs7457728：上游:AGTTCTTCTTCAATTTCTTTCATAGGT；下游：TTCATGCAACACTGTAGAGCT。②rs2516448 ：上游：ACGTTGGATGTCTCCTCCCTTTTTGCATCC ；下游：ACGTTGGATGCTTCATACATACACACACAC。

1.2.4 基因分型分析 通過Sequenom MassAR-RAY 技術對上述SNP位點進行分型。步驟：①目的基因擴增：取基因組DNA適量，依照順序加至384孔板，PCR擴增，反應物終濃度：基因DNA：5 ng；Taq聚合酶：0.1 U；PCR引物各2.5 pmol、dNTP 2.5 mmol。反應條件：94 ℃，15 min；95 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72℃，45 s循環40次，72 ℃，5 min。②SAP反應：剩余dNTP使用0.3 U堿性磷酸酶去除，條件：37 ℃，40 min；85 ℃，5 min。③單堿基延伸：添加5.4 pmol延伸引物以及dNTP和ddNTP的混合物50 μmol，Thermosequenase DNA聚合酶0.5 U，反應條件：94 ℃，2 min；94 ℃，5 s；55 ℃，5 s；72 ℃，5 s循環35次；72 ℃，3 min。④脫鹽、上機：將產物樹脂脫鹽15 min，點樣于SpectroCHIP芯片，基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜檢測芯片。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，組間基因頻率比較采用卡方檢驗，通過多因素logistic回歸分析VSTM2A、MICA基因型與宮頸癌發病風險的關系，P<0.05代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 等位基因頻率分布

病例組VSTM2A基因的rs7457728位點中C基因頻率高于對照組(P<0.05)；病例組MICA基因的rs2516448位點中T基因頻率高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 病例組與對照組等位基因頻率分布比較(頻數，%)

2.2 基因型分布

病例組VSTM2A基因的rs7457728位點中CC基因型頻率39.05%高于對照組9.52%，GG基因型頻率14.29%低于對照組44.76%(P<0.05)；病例組MICA基因的rs2516448位點中TT基因頻率37.14%高于對照組22.86%，CC基因頻率15.24%低于對照組26.67%(P<0.05)。見表2。

表2 病例組與對照組基因型分布比較(例，%)

2.3 VSTM2A、MICA基因多態性與宮頸癌發病風險的Logistic 回歸分析

運用廣義模型，對上述差異有統計學意義的2個位點進行Logistic 回歸分析，并進行賦值rs7457728(GG型=0，GC型=1，CC型=2)、rs2516448(CC型=0，CT型=1，TT型=2)，對年齡進行校正后，計算相對危險度OR(95% CI)，Logistic回歸分析結果顯示rs7457728位點中CC型是宮頸癌發生的危險基因型，OR值為1.980(95%CI：1.325～2.959)；rs2516448位點中TT型是宮頸癌發生的危險基因型，OR值為1.508(95%CI：1.029～2.210)。見表3。

表3 VSTM2A、MICA基因多態性與宮頸癌發病風險的Logistic 回歸分析

2.4 宮頸癌不同臨床病理特征VSTM2A、MICA基因多態性比較

不同分化程度、臨床分期、淋巴結轉移宮頸癌VSTM2A、MICA基因型分布情況比較，差異無統計學意義(P>0.05)；非鱗癌VSTM2A基因的rs7457728位點中CC基因型頻率高于鱗癌(P<0.05)；而不同組織類型MICA基因型分布情況比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 宮頸癌不同臨床病理特征VSTM2A、MICA基因多態性比較/例

3 討論

癌癥的發生與發展是多因素綜合的結果，除與區域性、社會經濟、受教育情況、性伴侶個數、首次性生活年齡、早育、多產、避孕情況、吸煙、飲酒、飲食習慣、家族史等生物行為有關外，還與個體基因及遺傳因素息息相關[5]。研究顯示[6]，基因遺傳度可解釋20%以上宮頸癌發生易感性，且疾病的基因遺傳效應較肺癌、結直腸癌等均更高，這提示基因多態性可能在宮頸癌發生發展過程中具有重要作用。

CHEN D等[7]在一項對于瑞典人宮頸癌的全基因組關聯研究(GWAS)中發現了MHC-rs2516448位點，并認為該位點基因多態性和宮頸癌發生密切相關。rs2516448是和A5.1連鎖的一個位點，A5.1是MICA的移碼突變點之一。MICA位于HLA Ⅰ類基因編碼區，含5個內含子以及6個外顯子，由于G核苷酸插入A5.1等位基因位置，造成移碼突變，終止密碼子TAA的出現提前，MICA基因表達改變，造成蛋白質分子縮短[8]。研究顯示[9]，大多數細胞中，此MICA基因不表達，但當病毒感染或是惡性腫瘤發生時，均可發現高頻率表達，這主要是由于機體感染或腫瘤細胞出現時，T細胞和NK細胞上表達的NKG2D能激活MICA。目前，MICA-A5.1的基因多態性已被證實和某些腫瘤的發生有關[10]。本研究中病例組T等位基因頻率高于對照組，TT基因型是宮頸癌發生的獨立危險因素，與上述研究結果一致。

VSTM2A定位于人體染色體7p11.2，7p11中，信號LD區中VSTM2A是唯一蛋白質編碼基因[11]。目前臨床上關于VSTM2A 在人體中作用研究較少，和惡性腫瘤之間的關系研究就更少。最新有關子宮癌的GWAS研究提示[12]，7p11區，VSTM2A的rs7457728位點與子宮癌易感性顯著關聯。本研究發現VSTM2A基因的rs7457728位點多態性與子宮癌的發生相關，VSTM2A基因的rs7457728位點攜帶G/G比攜帶G/C及C/C基因型的個體易患子宮癌腺癌的風險增加。與此同時本研究分析宮頸癌患者臨床病理特征與VSTM2A基因的rs7457728位點的關系，結果顯示非鱗癌VSTM2A基因的rs7457728位點中CC基因型頻率高于鱗癌。

綜上所述，VSTM2A基因的 rs7457728位點和MICA的rs2516448位點基因多態性與宮頸癌的發病風險有關，rs7457728位點中的CC基因型與rs2516448位點中的TT基因型可能是宮頸癌易感基因型。