FOXM1/FOXO3a在乙肝相關性肝癌中的表達及臨床意義

許君偉 梁亞林 宋 麗

肝癌通常是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的慢性感染引起[1]，病理學活檢為診斷的金標準，但其是有創性檢查，近年來影像學診斷逐漸被廣泛應用，但其診斷特異性仍待提高[2-3]。研究顯示：乙肝發展到乙肝相關性肝癌涉及多基因與腫瘤標志物在不同節點的表達[4]。甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、腫瘤抗原199(CA199)等腫瘤標志物在一些惡性腫瘤的診斷、病情判斷以及療效監測方面具有一定臨床價值[5]，但其特異性、敏感度仍不理想，因此更加可靠、準確的腫瘤標志物的相關研究仍是該腫瘤診斷的熱點研究內容[6]。FOXM1(forkhead transcription factor M1)基因在多種腫瘤中廣泛存在，可參與調控細胞增殖、分化、侵襲等。FOXO3a(forkhead box O3a)作為FOXM1上游調節因子，FOXM1/FOXO3a信號通路可以通過調節腫瘤細胞的生物學功能來發揮調控癌癥發生與發展的作用[7-8]。本文具體探討了FOXM1/FOXO3a在HBV相關性肝癌中的表達及臨床意義，希望為乙肝相關性肝癌的診斷和治療提供新的思路和方法。現總結報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

于2015年8月到2020年5月選擇的92例HBV相關性肝癌患者作為研究對象。納入標準：原發疾病均經病理學證實為HBV相關性肝癌，臨床及病理資料完整；無遠處及淋巴轉移；患者在病理檢查前均未接受過化療、放療和其他抗腫瘤治療；術前無嚴重的合并疾病；年齡20～75歲。排除標準：合并HCV感染的患者；伴有嚴重的其他疾病者；臨床與病理資料缺乏者。

本研究得到了醫院倫理委員會的批準與所有入選患者的知情同意。入選的92例患者中，年齡最小32歲，最大75歲，平均年齡(58.22±2.18)歲，其中≥60歲50例，<60歲42例；臨床分期：Ⅰ期35例，Ⅱ期35例，Ⅲ期22例；組織學分化：高分化43例，中分化27例，低分化22例；淋巴結轉移45例；Child-Pugh分級：A級45例，B級47例；糖尿病史32例、高血壓病史25例、吸煙史54例、飲酒史43例；病理特征：鱗癌32例，腺癌60例。實驗室指標：谷丙轉氨酶(ALT)(78.24±11.59)IU/l，谷草轉氨酶(AST) (67.21±12.04)IU/l，谷氨酰氨基轉移酶(GGT)(118.03±22.71)IU/l，乳酸脫氫酶(LDH)(220.19±32.71)IU/l，堿性磷酸酶(ALP)(132.19±34.19)U/l，AFP(872.71±128.29)μg/l，CEA(4.92±0.31)mg/l，CA199(58.22±14.29)U/ml。

1.2 FOXM1/FOXO3a表達檢測

SP免疫組化試劑盒購自中杉金橋公司，FOXM1兔抗人多克隆抗體(工作濃度1∶500)、FOXO3a兔抗人多克隆抗體(工作濃度1∶200)購于博奧森生物技術有限公司。二甲苯茂軍化工科技有限公司，PBS購自索萊寶生物科技有限公司，中性樹膠購自邁新生物技術開發有限公司。

取所有患者的病灶組織標本與癌旁組織標本，按照石蠟切片常規步驟進行制片并切片，然后經檸檬酸緩沖液高壓抗原熱修復預處理。取出抗原修復盒，待修復液自然冷卻，PBS洗滌3次，滴加3% H2O2，室溫靜置10 min；PBS洗滌3次，滴加正常山羊血清封閉液，室溫10～15 min。滴加抗MFGE8抗體2 μl，置于濕盒內，4 ℃過夜。PBS洗滌3次，滴加復合二抗2 μl，室溫靜置20 min；PBS洗滌3次后DAB顯色，光學顯微鏡下觀察并拍照。

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1.3 預后隨訪

以手術日期為起始時間，隨訪截至日期為2020 年8月1日，通過微信、門診、電話、入戶等隨訪方式，調查患者的預后生存與死亡情況。

1.4 統計方法

不同組織學分化、臨床分期、淋巴結轉移、Child-Pugh分級患者的FOXM1、FOXO3a表達陽性率對比差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2 結果

2.1 FOXM1/FOXO3a表達水平對比

在92例HBV相關性肝癌患者中，病灶組織的FOXM1、FOXO3a表達陽性率為72.8%和83.7%，都顯著高于癌旁組織的33.7%和23.9%(P<0.05)。見表1。

表1 不同組織的FOXM1/FOXO3a表達水平對比(例，%)

2.2 肝癌臨床病理特征與FOXM1/FOXO3a的相關性

應用SPSS 22.00進行統計分析，通過百分比以及均數±標準差來表示計數數據與計量數據，比較分別采用χ2檢驗和t檢驗，Pearson進行相關分析，COX進行多因素回歸分析，檢驗水準α<0.05。

表2 不同臨床病理特征HBV相關性肝癌患者的FOXM1/FOXO3a表達水平對比(例，%)

叉頭框(forkhead box，FOX)蛋白具有“翼狀螺旋結構”DNA結合域的轉錄因子，人類FOXM1基因定位12p13-3c，可刺激細胞由靜止期進入到細胞周期，從而調控細胞周期、細胞凋亡與增殖，從而與多種惡性腫瘤存在相關性[12]。FOXO3a定位于6q21，編碼673 個氨基酸，為胰島素/磷酸肌醇-3激酶的重要信號通路因子，其活性水平受到蛋白質-蛋白質相互作用、基因表達水平、翻譯后修飾、蛋白質穩定性等多種因素的影響[13]。本研究顯示在92例HBV相關性肝癌患者中，病灶組織的FOXM1、FOXO3a表達陽性率為72.8%和83.7%，都顯著高于癌旁組織的33.7%和23.9%(P<0.05)，表明FOXM1/FOXO3a信號通路在乙肝相關性肝癌中呈現激活表達狀態。

選用由吉林大學基礎醫學院提供的清潔級Wistar大鼠，雌、雄大鼠比例為1：1，體重250～280 g。

提升社會力量的食品安全監督力度。社會監督組織應該不斷強化自身的職責，在政府等相關部門的有效引導下，整合政府和食品企業發布的各項信息資源，利用媒體宣傳等手段表達自己的訴求。在日常的生活中一旦發現違法的食品企業或行為，應立即舉報。除此之外，法律監督部門也應該強化自身職責，利用立法和檢舉等方法從根源上杜絕食品安全問題的發生[2]。

表3 HBV相關性肝癌患者的FOXM1/FOXO3a表達水平與臨床病理特征的相關性(n=92)

2.3 預后情況

所有患者隨訪到2020 年8月1日，平均隨訪時間(25.82±1.38)個月，92例患者中死亡42例，死亡率為45.6%。

2.4 影響因素分析

肝癌為臨床上常見的惡性腫瘤之一，具有預后差，惡性程度高等特點。HBV相關性肝癌是原發性肝癌中的一種最主要類型，沿海地區高發，可發生于任何年齡段[9]。該腫瘤早期起病隱匿，往往發病就診時患者已處于中晚期，且常伴有癌栓與淋巴結轉移情況，使得其根治性手術切除的應用受到極大的限制，因而死亡率較高[9]。隨著分子生物學的發展，研究已表明癌基因激活與腫瘤抑制基因失活、等位基因的雜合性缺失、染色體不穩定與失衡、表觀遺傳性基因沉默等與癌癥發生發展密切相關，臨床上也已經出現了針對特定分子的靶向藥物治療[10-11]。

表4 乙肝相關性肝癌患者預后死亡的多因素分析(n=92)

3 討論

在92例HBV相關性肝癌患者中，以預后死亡作為因變量，COX回歸分析顯示組織學分化、臨床分期、淋巴結轉移與FOXM1、FOXO3a表達陽性率為影響患者預后死亡的主要因素(P<0.05)。見表4。

Pearson相關分析顯示患者的組織學分化、臨床分期、淋巴結轉移、Child-Pugh分級與FOXM1、FOXO3a表達陽性率都存在相關性(P<0.05)。見表3。

陽性判定標準：對細胞染色程度和陽性百分比進行乘積評分，兩項得分乘積≤3分為陰性，>3分為陽性。

本研究顯示不同組織學分化、臨床分期、淋巴結轉移、Child-Pugh分級患者的FOXM1、FOXO3a表達陽性率對比差異都有統計學意義(P<0.05)；Pearson相關分析顯示患者的組織學分化、臨床分期、淋巴結轉移、Child-Pugh分級與FOXM1、FOXO3a表達陽性率都存在相關性(P<0.05)。從機制上分析，FOXM1是一個重要的細胞周期調控因子，可調控腫瘤細胞增殖和侵襲等[14]。FOXM1過表達和E-cadherin表達下降與惡性腫瘤組織分化差、淋巴結轉移顯著相關，RNA干擾介導的FOXM1敲低能夠顯著抑制惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲與遷移[15]。FOXO3a是FOXM1轉錄因子的上游調節基因，也是PI3K-AKT信號通路的重要下游效應物，FOXM1/FOXO3a信號通路可以通過調節細胞增殖、凋亡、遷移、血管生成來調節惡性腫瘤的起始，也可影響腫瘤的病理特征[16-17]。

本研究所有患者隨訪到2020 年8月1日，平均隨訪時間(25.82±1.38)個月，92例患者中死亡42例，死亡率為45.6%；COX回歸分析顯示組織學分化、臨床分期、淋巴結轉移與FOXM1、FOXO3a表達陽性率為影響患者預后死亡的主要因素(P<0.05)。不過本研究也有一定的不足，研究的樣本數量較少，影響患者預后的因素比較多，因此研究可能存在一定的偏倚性，將在下一步進行深入分析。

管道平面設計原則：一要線路短、起伏小、土石方工程量小、造價經濟；二要考慮拐點數量、角度、過路、過溝，同時考慮避讓村莊、房屋、田地、輸電線路桿塔、墳地，減少拆遷及附著物賠償費用；三要盡量避免穿越河谷、山脊、沼澤和泄洪地區；四要考慮近遠期結合和分期實施的可能。

用三維軟件建立實體三維模型，在有限元仿真分析軟件中對三維模型進行網格劃分和材料屬性添加。實體三維模型如圖1所示。

總之，乙肝相關性肝癌的發病與FOXM1/FOXO3a信號通路的激活密切相關，且其相關蛋白的表達與患者的臨床病理特征顯著相關，可作為患者預后死亡評估的重要影響指標。