八角茴香揮發(fā)油防治新型冠狀病毒肺炎的潛在作用機制▲

黃丹娜 陳 路

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱市 150040，電子郵箱:dhuang202@126.com；2 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，南寧市 530023)

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)疫情的迅速蔓延給人類社會帶來巨大的威脅，其已成為當今全球關注的主要問題。目前尚無針對COVID-19的特效藥物，因此對現(xiàn)有藥物的重新利用研究可能會為遏制這一流行病帶來希望[1]。COVID-19的臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、干咳和乏力[2]，在中醫(yī)學中其屬于“寒疫”[3]“寒濕疫”[4]“濕毒疫”[5]病范疇。張伯禮院士提出，應在化濕解毒、辟穢化濁的基礎上對COVID-19患者因證施治[4]。芳香化濕之品具有祛濁避穢功效，因此古法防治瘟疫多用香囊[4]。八角茴香是一種藥食同源的常用香料，為木蘭科植物八角茴香的干燥成熟果實，性味辛溫，歸肝、腎、脾、胃經(jīng)，有溫陽散寒、理氣止痛之功效[6]。八角茴香具有抗菌、抗病毒和抗氧化的特性，不僅長期在我國的中醫(yī)藥領域中得到應用，在印度傳統(tǒng)醫(yī)藥阿育吠陀體系也被用于治療腸胃氣脹、痢疾、咳嗽、哮喘、風濕性關節(jié)炎等疾病[7]。八角茴香主要含揮發(fā)油，是其發(fā)揮藥效的重要成分，也是其最有商業(yè)價值的部分[8]。網(wǎng)絡藥理學是近年來新興的一門學科，是基于系統(tǒng)生物學、多向藥理學的研究方法，其將生物學網(wǎng)絡與藥物作用網(wǎng)絡整合，在藥物與疾病和靶點之間構建“多成分、多靶點、多途徑”協(xié)同作用關系，從而揭示藥物治療疾病的作用機制[9-10]。本文利用網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合分子對接方法，研究八角茴香揮發(fā)油有效成分及其靶點、疾病及生物通路的相互作用關系，預測其干預COVID-19的可能分子機制，為后續(xù)藥物研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 八角茴香揮發(fā)油主要活性成分與靶點的篩選 本課題組前期已采用氣相色譜-質譜聯(lián)用法對八角茴香揮發(fā)油的成分及含量進行了分析[11]，從該實驗結果中選取了4個相對含量≥1%且具有生物活性的化合物作為研究對象，分別是松油烯、萜品油烯、桉葉油醇、反式茴香腦(見表1)。通過TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和TCMID(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)數(shù)據(jù)庫，檢索主要活性成分的靶蛋白，并剔除沒有靶點的化學成分。同時，通過UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)，限定物種為“human”，查詢靶蛋白對應的基因，進行基因名稱標準化并去重。

表1 八角茴香揮發(fā)油4個活性成分的信息

1.2 八角茴香揮發(fā)油干預COVID-19的作用靶點預測 以Corona Virus Disease 2019和COVID-19為檢索詞，分別在GeneCards(www.genecards.org)、OMIM(https://omim.org/)和CTD(http://ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫進行檢索，檢索時間為建庫至2020年7月31日。將3個數(shù)據(jù)庫檢索結果合并，去除重復，獲取COVID-19相關靶點，利用微生信線上軟件(http://www.bioinformatics.com.cn/)將獲取的靶點與八角茴香揮發(fā)油化學成分靶點映射，得到共同靶點作為八角茴香揮發(fā)油干預COVID-19的潛在作用靶點。將八角茴香揮發(fā)油的活性成分與其干預COVID-19的潛在作用靶點導入Cytoscape 3.6.0軟件，構建其成分-靶點-疾病網(wǎng)絡。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡的構建與分析 將八角茴香揮發(fā)油干預COVID-19的潛在作用靶點導入STRING在線分析系統(tǒng)(https://string-db.org)，種屬選擇“Homo sapiens”，最低置信度分值設置為0.4，獲得蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)關系，以TSV文件格式保存。再將數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件進行可視化處理和拓撲分析，篩選關鍵靶點。

1.4 靶點的富集分析 將八角茴香揮發(fā)油干預COVID-19的潛在作用靶點導入Metascape在線分析系統(tǒng)(http://metascape.org)進行基因富集分析，閾值設定為P≤0.05，得到基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析結果和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析結果。

1.5 主要活性成分與靶點分子對接驗證 采用SwissDock在線軟件(http://www.swissdock.ch/)進行分子對接，使用UCSF Chimera軟件對分子結構進行處理，評價活性成分與新型冠狀病毒3CL水解酶(Mpro)、新型冠狀病毒受體血管緊張素轉化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)之間的對接效果，選取抗病毒藥利巴韋林作為對比；選取PPI網(wǎng)絡中Degree值排名前2的兩個關鍵靶點(PTGS2、JUN)，分析活性成分與關鍵作用靶點之間的對接效果。

2 結 果

2.1 八角茴香揮發(fā)油的活性成分及靶點 利用TCMSP和TCMID在線數(shù)據(jù)庫，獲得松油烯、萜品油烯、桉葉油醇、反式茴香腦這4種活性成分所對應的靶蛋白共76個，輸入UniProt數(shù)據(jù)庫進行基因名稱標準化并刪除重復值，得到52個靶點。

2.2 八角茴香揮發(fā)油干預COVID-19的作用靶點 從GeneCards、OMIM和CTD數(shù)據(jù)庫中篩選出與COVID-19相關的基因共5281個，與八角茴香揮發(fā)油活性成分的52個靶點相映射，得到 26個八角茴香揮發(fā)油干預COVID-19的潛在作用靶點(圖1-A)。將疾病、活性成分、潛在作用靶點導入 Cytoscape軟件構建活性成分—靶點—疾病網(wǎng)絡(圖1-B)。

圖1 八角茴香揮發(fā)油與COVID-19之間的網(wǎng)絡構建

2.3 PPI網(wǎng)絡分析 利用STRING 數(shù)據(jù)庫，針對八角茴香揮發(fā)油干預COVID-19的26個潛在作用靶點構建PPI網(wǎng)絡(圖2-A)，尋找靶點之間的直接及間接作用關系。利用Cytoscape軟件分析和處理數(shù)據(jù)(圖2-B)，網(wǎng)絡中節(jié)點的顏色深淺和大小與Degree值成正比，Degree值越大表示參與的生物功能越多；前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、JUN、核受體亞家族3C組成員1(nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1)、一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3，NOS3)、RELA、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9、MMP2、腎素等靶點的Degree值≥10，明顯高于平均值7.77，因此可能是關鍵作用靶點。

圖2 潛在作用靶點PPI網(wǎng)絡圖

2.4 靶點富集分析 由GO功能富集分析結果(圖3)可知，生物過程與有機羥基化合物轉運、對有毒物質的反應、胚胎著床、行為、神經(jīng)遞質代謝過程等相關；細胞組分與細胞膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、微小洞穴、質膜筏等相關；分子功能與核受體活性、轉錄因子活性、類固醇激素受體、RNA聚合酶Ⅱ 近端啟動子序列特異性DNA結合、近端啟動子序列特異性DNA結合等相關。KEGG通路富集分析結果(圖4)顯示，差異基因主要富集在癌癥通路、白細胞介素17信號通路、Th17細胞分化、腫瘤壞死因子信號通路、可卡因成癮、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、小細胞肺癌通路、Th1和Th2細胞分化通路、恰加斯病(美洲錐蟲病)、T細胞受體信號通路等。

圖3 GO功能富集分析結果

圖4 KEGG通路富集分析(顯示前20條結果)

2.5 分子對接結果 結果顯示，八角茴香揮發(fā)油有效成分與目標受體之間最低結合能均小于-5.0 kCal/mol，表明均有較好的對接活性[12-13]，見表2。在4個活性成分中，桉葉油醇與PTGS2、JUN、ACE2的對接效果最好，松油烯與Mpro的對接效果最好，見圖5。

表2 八角茴香揮發(fā)油主要活性成分與相關蛋白的對接效能(kCal/mol)

圖5 分子對接結構圖

3 討 論

八角茴香是芳香類藥用植物，性味辛溫，而辛入肺，辛能通氣、開腠理?，F(xiàn)代藥理研究顯示植物揮發(fā)油在抗炎、抗菌、抗病毒等方面有優(yōu)勢[14]，因此芳香類中藥可以用于改善COVID-19導致的呼吸道及消化道的有關癥狀。有研究表明，植物揮發(fā)油可與病毒包膜直接相互作用并減輕宿主的炎癥反應，例如桉葉油醇[15]；萜品油烯和松油烯為單萜物質，均具有較強的抗氧化性[16-17]；而作為八角茴香揮發(fā)油的主要成分，反式茴香腦也已被證實具有抑制病毒的活性[18]。因此，本研究選取了八角茴香揮發(fā)油中4個活性化合物——松油烯、萜品油烯、桉葉油醇、反式茴香腦進行分析。

本研究結果顯示，八角茴香揮發(fā)油干預COVID-19的主要作用靶點為PTGS2、JUN、NR3C1、NOS3、RELA、MMP9、MMP2、腎素等。其中，PTGS2又名環(huán)氧化酶2，是引起炎性反應的關鍵酶之一[19]，可通過直接調控p53功能活性抑制DNA損傷誘導的細胞凋亡[20]。近期一項對COVID-19患者肺形態(tài)蛋白質組學和致病性特征研究顯示，在COVID-19患者肺的代表性切片中可觀察到環(huán)氧化酶2在肺泡細胞中表達[21]。JUN又稱為轉錄因子復合物 AP-1，是由Jun和Fos等蛋白亞家族形成的二聚體轉錄因子，主要參與細胞增殖、轉化和死亡[22]。AP-1在前列腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌等腫瘤中表達失調,參與腫瘤形成和發(fā)展。另外，AP-1的過度活化也已被確定為哮喘發(fā)病過程中糖皮質激素抵抗的機制[23]。而在炎癥反應中，糖皮質激素可以抑制促炎性細胞因子的產(chǎn)生并刺激抗炎細胞因子的產(chǎn)生，其作用由NR3C1基因編碼的糖皮質激素受體介導[24]。糖皮質激素受體還能與核因子κB、AP-1作用，從而抑制這些轉錄因子在炎癥反應過程中對促炎靶基因的轉錄[25]。RELA為核因子κB p65亞單位，可對核因子-κB通路進行精準調控，在核因子κB介導的炎癥、癌癥等多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[26]。MMP家族是鋅依賴性的內(nèi)肽酶，在炎癥、腫瘤侵襲和轉移以及通過降解細胞外基質和基底膜生成血管過程中發(fā)揮重要作用[27]。NOS3基因多態(tài)性與一些由血管病變引起的疾病密切相關，如急性心肌梗死、原發(fā)性高血壓、冠心病和股骨頭缺血性壞死等[28]。腎素是研究原發(fā)性高血壓病因學的一個靶標基因，腎素將血管緊張素原裂解為血管緊張素1，進而被催化為血管緊張素2，從而影響血壓和電解質平衡[29]。以上提示，八角茴香揮發(fā)油的活性成分可能通過抗炎、抗癌、影響心血管系統(tǒng)等對COVID-19起到干預作用。

GO功能富集分析結果顯示，八角茴香揮發(fā)油可能在細胞膜筏、膜微區(qū)等位置，通過有機羥基化合物轉運、對有毒物質反應等生物學過程與核受體及轉錄因子等結合而發(fā)揮作用。KEGG富集結果顯示，八角茴香揮發(fā)油可能主要是通過癌癥通路作用于PTGS2、JUN、核因子κB相關蛋白、MMP家族(MMP9、MMP2)等靶點達到干預COVID-19 的目的。在前20個主要富集的KEGG通路中，涉及了與癌癥相關的信號通路如癌癥通路、腫瘤壞死因子信號通路、小細胞肺癌、前列腺癌等，以及白細胞介素17信號通路、Th17細胞分化、Th1和Th2細胞分化、核因子κB信號通路、T細胞受體信號通路、B細胞受體信號通路等與免疫和炎癥相關的多條通路，還涉及其他如乙型肝炎、恰加斯病(美洲錐蟲病)、利什曼病等傳染病的信號通路。臨床研究顯示，COVID-19重癥患者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征的原因可能與細胞因子風暴有關，細胞因子風暴表現(xiàn)為過激的炎癥反應，COVID-19患者體內(nèi)可能存在Th1與Th2反應失衡[30]。因此，除控制病毒復制外，阻止COVID-19患者出現(xiàn)細胞因子風暴也是治療的關鍵。另外，臨床上發(fā)現(xiàn)部分新型冠狀病毒感染患者出現(xiàn)了心肌損傷臨床征象，發(fā)病機制可能與病毒感染直接引起心肌細胞損傷、細胞因子風暴以及ACE2等有關[31]。ACE2是新型冠狀病毒結合的靶標蛋白，我國研究人員發(fā)現(xiàn)許多腫瘤中出現(xiàn)ACE2突變、拷貝數(shù)異常擴增等多種遺傳學異常；同時，ACE2在肺腺癌、胰腺癌、胃腺癌等惡性腫瘤中表達顯著上調并伴有ACE2啟動子區(qū)DNA低甲基化[32]。由此可見，基因富集分析與PPI網(wǎng)絡拓撲分析的結果相符。本研究認為八角茴香揮發(fā)油干預COVID-19的可能機制主要是通過抗腫瘤、抗炎、抗病毒、調節(jié)免疫、保護心血管等途徑發(fā)揮作用。

本研究通過分子對接分析八角茴香揮發(fā)油有效成分分別與關鍵作用靶點PTGS2和JUN的結合能，以及與SARS-CoV-2靶蛋白3CL水解酶和ACE2的結合活性，各分子對接結果的最低結合能均小于-5.0 kCal/mol，說明分子對接穩(wěn)定，并有可能影響新型冠狀病毒感染和復制的潛力。八角茴香揮發(fā)油可通過協(xié)同作用以發(fā)揮更大的防治效果，或者作為輔助藥用于增強其他抗病毒藥的作用，或者用于緩解COVID-19的癥狀。

綜上所述，八角茴香揮發(fā)油活性主要通過抗腫瘤、抗炎、抗病毒、調節(jié)免疫、保護心血管等通路，作用于PTGS2、JUN等關鍵作用靶點達到防治COVID-19的作用，這或可為八角茴香揮發(fā)油的后續(xù)深入研究以及防治COVID-19天然產(chǎn)物的篩選提供思路和方法，但結果的準確性仍需要臨床及基礎實驗研究進一步驗證。