一株CD10單克隆抗體的制備

翟晉豫，常秋霜，徐星星，王亞杰，張東輝，柴素真，李森

(1.河南賽諾特生物技術有限公司，鄭州 450001；2.河南省腫瘤病理診斷技術工程研究中心，鄭州 450001；3.鄭州市腫瘤病理診斷技術工程中心，鄭州 450001)

CD10又稱普通型急性淋巴細胞性抗原，屬于人類白細胞分化抗原系統。人們最初發現，其表達在來自成熟淋巴細胞譜系的白血病細胞中，是一種金屬蛋白酶，可以水解α-氨基形成的肽鍵[1]。隨著對CD10研究的不斷深入，人們發現其在正常細胞和腫瘤細胞中均有表達，并且在間質細胞中也有表達。在惡性腫瘤方面，CD10在乳腺癌[2]、結直腸癌[3]、胃癌[4]、前列腺癌[5]和腎細胞癌[6]等組織中的表達明顯高于正常組織，并且CD10表達量的多少與這些腫瘤的預后明顯相關[2，5，7]。因此，CD10也成為了多種腫瘤的標志物而用于臨床研究。此外，CD10也可以聯合其他標志物共同用于一些疾病的診斷。CD10/CD19/末端脫氧核糖核苷酸轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT)/CD45抗體組合可以用來檢測急性B細胞白血病微小殘留病[8]。CD10+多發性骨髓瘤癌基因1(multiple myeloma oncogene 1，MUM1)+和CD10-B細胞淋巴瘤(B cell lymphoma, Bcl)-6-MUM1-在彌漫性大B細胞淋巴瘤的臨床診斷和預后評價中具有重要作用[9]。

目前，醫院病理科應用CD10抗體做免疫組化臨床診斷已相當普及，但優質的抗體多為國外一些公司的產品，其不僅價格昂貴，而且購買渠道單一，易被壟斷。如何獲得一株優質的CD10抗體從經濟、社會層面顯得非常重要。本研究旨在制備可與進口CD10抗體相媲美的鼠單克隆抗體，以用于臨床免疫組化診斷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物BALB/c小鼠購于河南省動物實驗中心，6～8周齡，雌性，均飼養于河南省實驗動物中心SPF級動物房中。

1.2 材料及儀器pET28a質粒、DH5α菌株、BL21(DE3)菌株、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0均由河南賽諾特抗體中心實驗室保存；CD10基因模板及引物由南京金斯瑞生命科技有限公司合成；無縫克隆試劑盒購于上海近岸生物公司；His純化柱、Protein A純化柱為GE公司產品；小鼠5周快速免疫佐劑購于北京博奧龍公司；CD10免疫組化單克隆抗體購于Leica公司(克隆號為56C6)；膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購于Axygen公司。可調溫搖床購于天呈公司；臺式高速冷凍離心機購于Heal Force公司；AKTA純化儀購于GE公司；Western blotting化學發光分析儀和電泳儀購于上海天能公司；臨床檢測組織蠟塊由河南省腫瘤醫院惠贈。

1.3 方法

1.3.1 CD10抗原的制備 經蛋白預測軟件分析后選取人CD10分子的胞外區段，用PCR擴增獲得目的基因序列，將其與pET28a質粒連接，并轉化入BL21(DE3)菌株中表達目的蛋白，經鎳柱純化后獲得CD10蛋白。

1.3.2 CD10抗原與對照抗體的酶聯免疫學驗證 以200 ng/孔蛋白量包被CD10抗原，選2個復孔加CD10對照抗體(克隆號為56C6)，在其上、下2孔中加入PBS作為陰性對照，其余孔不加任何試劑作為空白本底對照，于37 ℃孵育30 min；將辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗鼠二抗以1∶2 000比例稀釋后加入各孔(100 μL/孔)，于37 ℃孵育30 min；將顯色液A和B各50 μL/孔等比例混勻后加入各孔，37 ℃反應5 min，加入終止液，于酶標儀上450 nm波長處讀取數值。

1.3.3 CD10抗原與對照抗體的Western blotting驗證 配制12%分離膠及5%濃縮膠，取5 μg蛋白加入上樣孔中，平行做兩部分上樣，一半做染色、脫色，用于鑒定目的蛋白純度，另一半做轉膜，用于Western blotting驗證。將做Western blotting的一半膠切下，轉移到0.45 μm孔徑的NC膜上，恒壓(100 V)轉90 min；用5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h；CD10對照一抗濃縮液(克隆號為56C6)以1∶5 000稀釋后加到NC膜上，4 ℃過夜孵育；羊抗鼠HRP二抗以1∶2 000比例稀釋后37 ℃孵育1 h；加入高敏化學發光液，用化學發光分析儀進行檢測。

1.3.4 CD10單克隆抗體的制備 用CD10抗原免疫3只小鼠，使用等體積的小鼠5周快速免疫佐劑，按照100 μg/只劑量注射入小鼠腿部肌肉進行免疫，3周后進行第2次免疫，劑量及方式與第1次相同，2周后取尾血，采用間接ELISA檢測抗體效價水平以確定融合小鼠(105<效價≤106)。融合前3 d，向小鼠尾靜脈注射單獨的抗原(100 μg/只)，對其沖擊免疫。調節SP2/0細胞至對數生長期并計數，在無菌條件下取小鼠脾臟研磨、計數，兩者以1∶5的比例混勻，離心，在37 ℃下用PEG4000融合[10-11]后均勻鋪到6塊96孔板中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，10 d后用間接ELISA檢測細胞上清液中抗體的分泌情況。取陽性孔細胞用有限稀釋法進行多次亞克隆篩選，獲得單株細胞。將該細胞大量培養，以500 000～2 000 000個/只的劑量植入預先已注入石蠟油的小鼠腹腔，待小鼠肚子脹大后收集腹水。使用Protein A純化柱純化腹水，獲得抗體。

1.3.5 CD10抗體的鑒定 利用河南賽諾特抗體中心實驗室已有的其他幾類與淋巴瘤檢測相關的蛋白[CD5、CD21、CD23、Bcl-2、Bcl-6、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、Ki-67]和間接ELISA對上述所制備的抗體進行交叉性驗證。同時，為驗證經上述篩選所獲得的抗體在真實組織中的反應情況，以彌漫性大B細胞淋巴瘤為例，通過免疫組化方法進行鑒定，同時以購于Leica公司的CD10單克隆抗體(克隆號為56C6)為陽性對照，以未免疫小鼠的血清為陰性對照，對所制備的抗體進行鑒定。

1.3.6 抗體的臨床評價 取淋巴瘤等組織蠟塊共38例，每個蠟塊連續切片2張，65 ℃烤片2 h，用二甲苯脫蠟水化，EDTA堿修復液高壓修復，過氧化物酶封閉，分別加入自制抗體和Leica公司的對照抗體(克隆號為56C6)，37 ℃孵育1 h，再加入一抗封閉劑后加入羊抗鼠HRP二抗，二氨基聯苯胺染色，蘇木精復染，脫水，封片，于顯微鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 CD10抗原的制備運用原核表達的方法構建CD10胞外區段蛋白作為免疫小鼠的抗原。SDS-PAGE結果顯示，在相對分子質量約38 000處有一條明顯的蛋白條帶，符合目的蛋白理論值大小，其純度較高，可以用作免疫抗原。(圖1)

注：1為純化前蛋白樣本；2為純化后蛋白樣本；3為蛋白marker。圖1 CD10蛋白純化后的電泳鑒定

2.2 ELISA及Western blotting鑒定純化后的蛋白與CD10對照抗體(克隆號為56C6)經ELISA檢測，可以看到目的蛋白與對照抗體發生明顯的免疫反應；Western blotting結果顯示，在相對分子質量為38 000處有一條明顯的特異性條帶，說明所得到的蛋白與CD10對照抗體發生了特異性反應。(表1、圖2)

表1 CD10蛋白與對照抗體的ELISA分析

注：1為蛋白marker；2和3為CD10蛋白上樣孔，為2個重復。圖2 CD10蛋白與對照抗體的Western blotting分析

2.3 抗體交叉反應鑒定本研究經多次克隆化篩選，最終得到7株單克隆抗體，分別命名為C1E8、C1F6、C2G3、C3H2、C5D7、C6D1、C6F2。與CD5、CD21、CD23、CyclinD1、Bcl-2、Bcl-6、Ki-67抗原進行交叉反應驗證，結果顯示，7株抗體均與CD10發生良好的反應，而與其他抗原之間無反應。(表2)

表2 7株抗體與各抗原間交叉反應的ELISA分析

2.4 抗體的鑒定鑒定所制備的7株單克隆抗體能否與彌漫性大B細胞淋巴瘤組織中的CD10抗原發生結合及結合能力的強弱，其判定標準：>10%的腫瘤細胞膜呈現弱陽性或只有部分細胞膜著色判定為“+”；>15%的腫瘤細胞膜呈現弱～中強陽性的完整膜著色判定為“++”；>30%的腫瘤細胞膜呈現完整的膜著色判定為“+++”。統計結果顯示，C2G3、C3H2在免疫組化試驗中為陰性，C1E8(+)、C1F6(++)、C5D7(+)、C6D1(+++)、C6F2(+)這5株單克隆抗體在免疫組化試驗中均能與彌漫性大B細胞淋巴瘤發生陽性反應，但C6D1的陽性率最高，與陽性對照抗體一致，適宜用于進一步研究。將其余克隆號細胞株凍存保種。

2.5 抗體的臨床評價取同樣的2張切片，一張用于本研究所制備的CD10抗體(克隆號為C6D1)檢測，另一張用于Leica公司CD10抗體(克隆號為56C6)檢測。本次評價共選取38種組織，進行免疫組化染色。經過大量臨床組織驗證，本研究所制備的CD10抗體(克隆號為C6D1)在常見腫瘤組織及正常組織的染色強度、定位及特異性上與Leica公司CD10抗體(克隆號為56C6)相一致，說明本研究所制備的CD10抗體可以用于臨床診斷。(表3、圖3)

表3 不同CD10抗體在38種組織中的臨床評價

注：A.扁桃體組織免疫組化結果；B.肝臟組織免疫組化結果；C.腎透明細胞癌組織免疫組化結果；D.胎盤組織免疫組化結果。圖3 本研究所制備的CD10抗體(克隆號為C6D1)與Leica公司CD10抗體(克隆號為56C6)在各組織中的免疫組化結果(×100)

3 討論

目前，對于CD10在腫瘤發生、發展過程中所起的作用尚不清楚。Iwaya等[12]研究發現，在腫瘤間質細胞中CD10的表達與腫瘤的淋巴轉移和復發呈正相關。CD10在正常和疾病狀態下的表達提示，其可能在細胞外基質降解及調節細胞間黏附、遷移中起重要作用，同時也可能參與腫瘤的浸潤和轉移。因此，在一些惡性腫瘤如淋巴瘤、非小細胞肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌等的臨床診斷中，CD10作為一種腫瘤標志物發揮著日益重要的作用。一株好的CD10抗體在免疫組化試驗中具有非常大的應用價值。

本研究通過原核表達的方法獲得CD10抗原并用其免疫小鼠，經細胞融合后篩選出一株可用于臨床免疫組化診斷的抗體。經比較發現，該抗體與目前市場上用得最廣泛的克隆號為56C6的抗體染色效果基本一致。因受限于樣本組織的獲得，后續仍需繼續驗證該抗體在各種組織中的染色定位，爭取做出一株可以替代國外品牌的抗體，緩解國內抗體稀缺、被國外抗體壟斷的局面。