T細胞與腫瘤細胞共培養方法及其應用進展

趙慶敏，劉永琦，李佳蔚，李玲，李程豪，李研

(1.甘肅中醫藥大學 甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究省級重點實驗室，蘭州 730000；2. 湖北省武漢市武昌區積玉橋街社區衛生服務中心，武漢 430000；3.甘肅中醫藥大學 敦煌醫學與轉化省部共建教育部重點實驗室，蘭州 730000)

腫瘤微環境的組成除了腫瘤細胞外，還有大量免疫細胞、基質細胞和各種可溶性因子，在腫瘤微環境中，腫瘤細胞與免疫細胞相互影響，前者通過各種信號轉導途徑調節微環境中免疫細胞的組分及細胞因子的分泌，構建適合自身生長的微環境。而T細胞作為腫瘤微環境中主要的免疫細胞，在腫瘤發展和臨床治療的各個階段發揮重要作用，是介導腫瘤適應性免疫的重要組成部分，在抗腫瘤免疫中發揮關鍵作用[1]。T細胞分類方式多樣，成熟T細胞可分為CD4+和CD8+T細胞，CD4+T細胞也被稱為Th，通過MHC Ⅰ類分子與抗原直接結合；CD8+T細胞也被稱為CTL，通過MHC Ⅱ類分子與抗原直接結合，在腫瘤免疫中發揮不同作用。T細胞和腫瘤細胞體外共培養存在一定難度，各種培養方法缺乏統一性，也無共培養相關資料可參考。文章主要對CD4+和CD8+T細胞與腫瘤細胞共培養的應用進行歸納，也對其他淋巴細胞，如PBMC、CD3+T細胞和人急性T淋巴細胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)Jurkat T細胞與腫瘤細胞共培養的方法進行了簡單總結，旨在為免疫治療和免疫機制的研究提供參考。

1 CD4+T細胞-腫瘤細胞共培養系統

1.1 腫瘤細胞對CD4+T細胞的影響免疫微環境是多種細胞或因子參與的復雜環境，T細胞與腫瘤細胞可以產生大量細胞因子，腫瘤細胞可以產生細胞因子影響T細胞的分化類型，在免疫微環境中發揮作用。例如，原發性胃癌細胞和胃癌細胞系都可誘導T細胞發生轉化。Lu等[2]首先證實胃癌患者腫瘤部位Treg數量龐大，將CD4+T細胞與原發性胃癌細胞以1∶2比例在Transwell小室培養5 d，結果證明原發性胃癌細胞可通過TGF-β1誘導初始T細胞向Treg轉化。Yuan等[3]也做了類似研究，但使用CD4+T細胞與胃癌細胞上清液共培養，也發現胃癌細胞(MGC-803、SGC-7901)通過TGF-β1誘導CD4+CD25-初始T細胞向Treg轉化。實驗中CD4+T細胞與腫瘤細胞共培養后發現腫瘤細胞可分泌細胞因子影響Treg的產生，并在胃癌微環境中發揮作用。

1.2 Treg對腫瘤細胞的影響Treg占CD4+T細胞的一小部分，是適應性免疫反應的調節細胞，在維持自身抗原耐受中起重要作用，也提供了與腫瘤微環境相關的抑制作用。Foxp3是Treg的標志性分子之一，對Treg的發育及功能發揮起關鍵作用[4-5]。Peng等[6]發現，Treg與非小細胞肺癌細胞共培養后，微環境中Foxp3水平的增加可能促進腫瘤細胞的生長，將健康人Treg與非小細胞肺癌細胞 95D以2∶1比例于Transwell小室共培養14 d后發現，Treg中Foxp3表達量顯著增加，95D細胞中的基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)表達量上調，且95D細胞活力和侵襲能力增強，腫瘤生長得到促進。Treg作為重要的免疫細胞類型，有關其標志性分子Foxp3在微環境中發揮作用的機制還有待探討。劉瑞敏等[7]將健康人CD4+T細胞與穩定轉染高表達Foxp3的肺癌細胞株(NCIH-hFoxp3細胞)以1∶1比例于Transwell小室共培養72 h，發現活化CD4+T細胞的增殖水平和活性降低，高表達Foxp3的腫瘤細胞可能通過這種方式逃避機體免疫監視，和Treg的調節作用相似。研究將Treg和腫瘤細胞共培養，以及CD4+T細胞與高表達Treg標志性分子的腫瘤細胞共培養，共同探討了Treg及其標志性分子Foxp3在肺癌微環境中的作用及機制。

1.3 靶點抑制劑對Treg和腫瘤細胞的影響組織蛋白酶S(cathepsin S，CatS)是一種在多種疾病過程中發揮重要作用的半胱氨酸蛋白酶，尤其與腫瘤的關系是近年來研究的熱點。Yan等[8]發現CatS抑制劑具有降低 Treg免疫抑制活性的作用，進一步的研究揭示了CatS抑制劑在腫瘤細胞存在時對T細胞的影響：將CatS抑制劑處理的Treg與鼠膀胱癌細胞MB49或脾臟細胞以1∶1比例共培養24 h，與PBS處理的Treg相比，抑制劑處理的Treg與腫瘤細胞共培養后，Treg增殖減少，凋亡增多；抑制劑處理的Treg與脾臟細胞共培養后，B細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞增殖水平明顯降低；但在脾臟細胞中加入腫瘤細胞條件培養液后，B細胞和CD4+T細胞增殖能力變化不顯著，但CD8+T細胞增殖增多，凋亡減少。以上表明CatS抑制劑在正常條件下抑制Treg并降低總體T細胞免疫，在腫瘤細胞存在條件下增強了CD8+T細胞免疫。研究將Treg和腫瘤細胞共培養，探討靶點抑制劑對Treg和膀胱癌細胞的影響，也揭示其影響膀胱癌微環境中免疫功能的可能機制。

1.4 其他免疫細胞對CD4+T細胞和腫瘤細胞的影響免疫微環境是多種細胞或因子等參與的復雜環境，淋巴管內皮細胞(lymphatic endothelial cell，LEC)是淋巴管內皮的主要成分，在宿主固有免疫應答的啟動中發揮重要作用。LEC不僅可以發揮抗原提呈作用，還分泌促炎細胞因子和趨化因子以調節免疫應答[9-10]。Tokumoto 等[11]將分選的CD4+T細胞、胃癌患者來源的LEC和胃癌細胞OCUM12以1∶3∶30比例共培養3 d，觀察到在腫瘤細胞誘導的炎癥條件下，LEC與CD4+T細胞相互作用，抑制后者產生細胞因子，從而抑制T細胞免疫應答。將CD4+T細胞、LEC和腫瘤細胞共培養為探討其他類型免疫細胞對T細胞和腫瘤細胞的影響及可能機制提供了參考。

1.5 免疫檢查點對CD4+T細胞的影響近年來免疫檢查點再次受到研究者的關注，其對于很多腫瘤，尤其是惡性且化療耐受的腫瘤患者有著顯著效果。PD-1和CTLA-4在調節T細胞免疫反應中發揮重要作用，但部分患者不能從中獲益。T細胞免疫球蛋白黏蛋白3(T-cell immunoglobulin mucin 3， TIM-3)以及淋巴細胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3，LAG-3)分子是熱門的免疫檢查點分子，雖屬同一類共抑制受體，但其發揮功能的機制并不相同。Ozkazanc等[12]將CD4+T細胞與5種不同髓系白血病細胞分別以1∶0.25、1∶2和1∶4比例共培養96 h，不同比例和時間條件下TIM-3和LAG3受體變化趨勢不同，但持續共刺激96 h后，CD4+T細胞表面PD-1、CTLA-4、TIM-3和LAG3的表達均上調，除了T細胞活化抗體的影響，白血病細胞信號在其中不僅刺激了T細胞反應，而且誘導了共抑制受體的表達。實驗將CD4+T細胞與腫瘤細胞共培養研究了T細胞共抑制受體對T細胞及相關因子的影響，也為闡明共抑制信號對T細胞影響機制提供了幫助。

1.6 嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)-T細胞過繼免疫療法的應用近年來腫瘤免疫治療方法之一的過繼性免疫治療成為熱門，其以多種形式通過調節自身免疫系統以治療腫瘤，例如CAR-T細胞治療即CAR-T療法，通過對T細胞進行修飾，體外擴增后回輸至患者體內，改造T細胞獲得特異性識別腫瘤細胞的能力。CAR-T細胞過繼免疫療法也在外周T細胞淋巴瘤中發揮作用，擴展了腫瘤患者的治療可能。例如，Pinz等[13]轉染了來自CD4+T細胞的CAR-T細胞與表達CD4的間變性大細胞淋巴瘤KARPAS 299細胞，分別以2∶1、 5∶1和10∶1比例共培養24 h。CD4+CAR-T細胞在擴增后產生大量CD8+T細胞并清除了腫瘤細胞，表明其在CD4+的間變性大細胞淋巴瘤細胞中有效，可用作移植或獨立治療外周T細胞淋巴瘤。實驗將CD4+CAR-T細胞與腫瘤細胞共培養，發現淋巴瘤細胞明顯減少，這擴展了外周T細胞淋巴瘤的治療范圍，為有效的臨床治療提供了可能。

2 CD8+T細胞-腫瘤細胞共培養系統

2.1 趨化因子對腫瘤細胞和CD8+T細胞的影響腫瘤微環境中存在大量各種類型的趨化因子，趨化因子是細胞遷移和細胞間相互作用的必不可少的調節因子，了解趨化因子與腫瘤細胞之間的相互影響以及它們對免疫反應和腫瘤轉移的影響，對腫瘤的發展至關重要[14]。Sugasawa等[15]將PBMC、CD4+T細胞、CD4-T細胞或CD8+T細胞與胃癌細胞以2∶1比例共培養48 h，發現CD4+T細胞產生大量趨化因子配體5(C-C chemokine ligand 5，CCL5)促進胃癌細胞(MKN45、KATOⅢ)增殖，CCL5處理的胃癌細胞通過Fas/FasL途徑誘導CD8+T細胞凋亡，證明胃癌細胞可通過誘導CCL5的表達獲得增殖及病情進展。此研究方法中T細胞與腫瘤細胞的共培養為研究趨化因子在胃癌微環境中的影響提供了合適模型，也為了解胃癌發展機制提供了基礎。

2.2 免疫檢查點對CD8+T細胞的影響免疫檢查點被證明在多種腫瘤中效果顯著。PD-1和CTLA-4是目前研究最多的檢查點分子，在腫瘤微環境中，腫瘤細胞表達免疫檢查點配體PD-L1與T細胞表面的PD-1結合介導腫瘤免疫逃逸。針對其途徑的抑制能夠有效解除T細胞的抑制狀態，對腫瘤細胞進行殺傷。Huang等[16]將健康供體來源的CTL與過表達PD-L1的肝細胞癌細胞以10∶1比例共培養48 h，發現CD8+CTL通過HLAⅠ類分子顯著上調肝癌細胞(Bel7402、HepG2)PD-L1的表達，其過表達又影響CD8+CTL中IFN-γ的分泌，表明PD-L1表達與CD8+CTL體外抗腫瘤反應有關。免疫檢查點PD-1除了配體PD-L1，還有另一個配體PD-L2，其在調節T細胞功能中發揮重要作用。Leng 等[17]將CD8+T細胞與轉染的過表達PD-L1和PD-L2的人食管癌細胞Ec109以5∶1比例培養48 h，發現PD-L1組CD8+T細胞增殖，PD-L2組CD8+T細胞減少，阻斷信號通路都可以抑制其作用。以上表明PD-L1和PD-L2發揮的免疫作用可能不同，但有關PD-L2的研究較少，PD-L2可能還有除PD-1外的其他受體[18]，其確切作用和分子機制還需進一步研究。該模型的建立也為闡明免疫檢查點其他配體的作用和可能機制提供了基礎。

除了最常見的免疫檢查點分子PD-1外，還有一些新型的免疫檢查點在腫瘤中也發揮重要作用。T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白(T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT)是一種抑制T細胞反應的免疫檢查點分子，它與配體CD155以高親和力結合并與配體CD112低親和力結合，在體內CD226與它競爭結合2個配體，是復雜配受體網絡的一部分[19]。He等[20]將健康人來源的CD8+T細胞和CD8+TIGIT+T細胞與胃癌細胞SGC7901以5∶1比例共培養，證明胃癌細胞可以誘導CD8+T細胞表面TIGIT表達。TIGIT與腫瘤細胞表達的配體CD155結合抑制CD8+T細胞代謝和效應功能，這些作用可以被葡萄糖或TIGIT阻斷中和，支持CD155/TIGIT可作為胃癌潛在的治療靶點。表達TIGIT的CD8+T細胞與腫瘤細胞的共培養為闡明腫瘤微環境中TIGIT及其配體的作用機制提供了參考，也為胃癌提供了更多可能的治療靶點。

2.3 CD8+Treg的轉化和免疫機制研究CD4+Treg和CD8+Treg是2個主要的Treg類型，與CD4+Treg相比，CD8+Treg研究得較少，它與組織損傷、自身免疫性疾病和腫瘤密切相關[21]，也可通過多種機制在實體器官移植以及移植物抗宿主病中發揮重要作用[22]。Zhang等[23]發現卵巢癌患者中CD8+Treg亞群增加，Treg的標志性分子表達增加，研究將CD8+T細胞與2種卵巢癌細胞以5∶1比例在Transwell小室中共培養5 d，發現CD8+T細胞中Foxp3+、CTLA-4+和CD28+T細胞比例增加。通過對表型和細胞因子分泌的分析顯示，與卵巢癌細胞共培養后，外周血CD8+T細胞誘導CD8+Treg的產生并抑制初始CD4+T細胞的增殖，對CD4+T細胞的抑制可能部分通過TGF-β1和IFN-γ介導。將CD8+T細胞與腫瘤細胞共培養闡明了特殊類型CD8+T細胞與腫瘤細胞的相互作用及其可能機制，也為研究免疫微環境中復雜的免疫機制提供了幫助。

2.4 CTL過繼免疫療法的應用CTL過繼免疫療法通過分離特異性CTL，體外擴增并輸注至患者體內以殺傷腫瘤細胞，是主要的過繼免疫療法之一。IL-18是一種多效性細胞因子，參與調節固有和適應性免疫應答，也可調節CTL和中性粒細胞活性，在其他細胞因子存在的條件下還能誘導NK細胞等的功能[24]。Kohyama等[25]使用腫瘤患者來源的CD8+CTL與多形性膠質母細胞瘤細胞TKB9、胃腺癌患者腹水來源的GT3TKB和腎癌細胞TUHR13TKB以10∶1比例共培養24 h，研究發現IL-18在體外直接激活CD8+CTL并增強其對體內腫瘤的細胞毒活性，未加入IL-18的CD8+CTL無明顯的細胞毒活性，但與IL-18孵育7 d后也顯示出細胞毒活性，證明IL-18為CTL過繼免疫療法的優化提供了新方案。將患者來源的CTL與多種腫瘤細胞共培養，為膠質母細胞瘤、胃腺癌、腎癌等提供了過繼免疫治療的可能，細胞因子的加入為優化過繼免疫治療提供了有效支持。

3 各種T細胞與腫瘤細胞共培養方法

T細胞作為腫瘤微環境中主要的免疫細胞，分類方式多樣，下表主要列舉了與腫瘤細胞共培養的PBMC、CD3+、CD4+和CD8+T細胞以及永生化的Jurkat T細胞，將幾種類型T細胞與腫瘤細胞的共培養方法作一簡單總結，希望為免疫治療和免疫機制的研究提供參考(表1)。

表1 T細胞與腫瘤細胞共培養方法概述

4 結語

近年來，腫瘤免疫治療表現出巨大的潛力，免疫檢查點和過繼免疫治療等通過改變T細胞的活性有效發揮抗腫瘤作用，T細胞在腫瘤微環境中的作用越來越不可忽視。文章將T細胞與腫瘤細胞共培養的具體方法作一總結，發現現有的有關T細胞和腫瘤細胞共培養的文獻主要涉及在腫瘤微環境中，模擬腫瘤細胞、T細胞、其他免疫細胞、趨化因子和細胞因子等的相互作用，主要應用于T細胞與腫瘤細胞間的相互作用，部分應用于免疫檢查點和過繼免疫治療，還有一小部分應用于靶點治療和新型療法，探討了T細胞對腫瘤細胞或腫瘤細胞對T細胞，以及其他免疫相關因素等對T細胞和腫瘤細胞的影響及機制。這仍是研究難點，例如T細胞與腫瘤細胞的體外培養是否需要DC等APC的參與；免疫檢查點在體外的研究怎樣更好地模擬體內微環境；抗PD-1和CTLA-4抗體在部分患者中應答率不高，是否可以與其他共抑制受體，例如TIM-3和LAG3等聯合優化免疫治療效果，仍需進一步的實驗支持。文章綜述了各種T細胞與腫瘤細胞的培養方法和應用，期望對T細胞與腫瘤細胞以及T細胞、其他免疫細胞和腫瘤細胞的研究提供參考，也為腫瘤的免疫機制和免疫治療探索提供幫助。