PD-1/PD-L1單抗及聯合其他療法增強結直腸癌療效的研究進展

劉佳程，胡晨曦，李玥，姜偉，劉偉，2

(1. 河北醫科大學基礎醫學院 免疫學教研室，石家莊 050051；2. 河北省重大疾病的免疫機制及干預重點實驗室，石家莊 050017)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的惡性腫瘤，50%～60%的患者在診斷時已發生轉移。化療是CRC患者的標準治療方法，但該方法具有選擇性低、腫瘤部位藥物濃度低、全身毒副作用明顯等局限。目前，FDA已批準包括西妥昔單抗、帕尼單抗、瑞戈非尼單抗、阿柏西普單抗、雷莫蘆單抗及貝伐單抗在內的6種治療轉移性結直腸癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)的靶向藥物，提高了患者總生存率[1]。

2018年中國臨床腫瘤學會發布的CRC診斷指南，增加了錯配修復(mismatch repair，MMR)蛋白和微衛星不穩定(microsatellite instability，MSI)檢測結果的判斷原則和兩者之間相關性的解釋，即錯配修復基因表達缺失型(deficient mismatch repair，dMMR)表現為高頻度微衛星不穩定(microsatellite instability-high，MSI-H)， 錯配修復基因表達正常型(proficient mismatch repair, pMMR)表現為低頻度微衛星不穩定(microsatellite instability-low，MSI-L)或微衛星穩定(microsatellite-stable，MSS)，分子標志物檢測使得對患者的治療從規范化逐步邁向精準化。dMMR/MSI-H mCRC患者是一個獨特的生物標志定義人群，約占CRC患者總數的4%[2]，具有突變負荷高、抗原新表位數量多、CTL浸潤不足及免疫檢查點表達水平高等特點，患者從傳統治療中獲益少[3-4]。免疫檢查點抑制劑抗PD-1抗體可增強腫瘤抗原特異性CD8+T細胞的抗腫瘤活性，這與dMMR/MSI-H mCRC患者中腫瘤對治療的反應高度持久和安全可控相關[5]。臨床和動物試驗顯示，將PD-1/PD-L1抑制劑與其他治療手段聯合可進一步增強CRC療效。

1 PD-1/PD-L1單抗治療

1.1 PD-1/PD-L1通路T細胞表面的PD-1與腫瘤細胞中表達上調的PD-L1結合，可抑制T細胞增殖活化，使腫瘤細胞逃脫免疫檢查。TCR與APC表面的MHC分子結合傳遞活化信號，可使T細胞釋放IFN-γ，IFN-γ與腫瘤細胞表面相應受體結合后通過JAK-STAT信號通路啟動干擾素應答基因的表達，如IRF-1，它與PD-L1啟動子結合，致使腫瘤細胞表面高表達PD-L1[6]。PD-1與PD-L1結合后，PD-1中ITSM結構域發生磷酸化并募集SHP-2，使下游的Syk和PI3K去極化，進一步抑制T細胞增殖和細胞因子產生[7]。PD-1抑制劑可引起腫瘤微環境中CD8+T細胞和DC間的相互作用，促使IFN-γ(CD8+T細胞)和IL-12(DC)分泌增加，發揮抗腫瘤作用[8]。

1.2 納武利尤單抗、帕博利珠單抗和阿特珠單抗治療2017年FDA批準納武利尤和帕博利珠單抗用于治療dMMR/MSI-H mCRC。CRC患者的微衛星狀態是免疫檢查點抑制劑療效的重要預測指標，MSI-H患者經抗PD-1藥物治療的客觀緩解率(objective response rate，ORR)、無進展生存期(progression-free survival，PFS)明顯高于MSI-L/MSS患者。dMMR腫瘤細胞易發生體細胞突變及異常突變蛋白高表達，腫瘤組織中有較多淋巴細胞浸潤，同時腫瘤細胞更易表達PD-L1[9]。在MSI-H型CRC中，在低劑量IFN-γ的影響下，PD-L1表達顯著上調，并且MSI-H細胞系可通過JAK-STAT信號通路對IFN-γ表現出高反應性[10]。這可能是MSI-H CRC患者應用抗PD-1抗體治療預后好，抗體治療應答率高的原因。

納武利尤單抗作為以PD-1為靶點的單抗藥物，被廣泛用于治療包括dMMR/MSI-H mCRC在內的多種腫瘤。Ⅱ期臨床試驗CheckMate 142招募了來自8個國家、31個地區被確診為dMMR/MSI-H型CRC的患者74名，其中40名曾接受過3次及以上其他治療，每2周給予患者3 mg/kg 納武利尤單抗治療(表1)。結果發現，在中位隨訪時間為12個月[四分位距(interquartile range，IQR)范圍8.6～18.0]時，23名患者(31.1%，95%CI20.8%～42.9%)達到了研究者評估的ORR，51名患者(68.9%，95%CI57.0%～79.0%)的疾病控制時間持續12周或更長，所有應答者均存活，8名患者持續緩解12個月或更長時間。患者不良反應癥狀輕，最常見的3～4級與藥物相關的不良反應是脂肪酶和淀粉酶濃度升高。以上表明納武利尤單抗為既往治療過的dMMR/MSI-H mCRC患者提供了持久的疾病緩解率和疾病控制[11,17-18]。

帕博利珠單抗是FDA于2017年5月批準用于治療dMMR/MSI-H實體腫瘤患者的PD-1抑制劑。dMMR可使腫瘤對帕博利珠單抗高度敏感，患者對免疫檢查點阻斷治療反應良好且持久，毒副作用很小[19]。一項Ⅱ期臨床試驗中，靜脈給予41名CRC患者每2周10 mg/kg 帕博利珠單抗治療，其中患者先前至少接受了2次及以上其他治療(表1)。結果顯示，MSI-H mCRC患者的ORR為40%，PFS為20周的占78%；而MSS mCRC患者的ORR為0，PFS為20周的占11%，進一步研究發現體細胞高突變負荷與PFS的延長相關(P=0.02)[4]。一項回顧性研究中，選取了3家醫院8名晚期MSI-H CRC患者，其中4名局部進展，4名轉移。所有患者均接受了納武利尤單抗或帕博利珠單抗治療。結果發現，PD-1抗體可致晚期dMMR/MSI-H CRC患者腫瘤消退，有較好的療效和安全性[20]。Ⅱ期臨床試驗KEYNOTE-164評估了帕博利珠單抗在已接受治療的dMMR/MSI-H CRC患者中的抗腫瘤活性，患者在長達2年內每3周接受200 mg 帕博利珠單抗治療，其中患者接受過≥2種標準治療，包括氟嘧啶、奧沙利鉑和伊立替康(隊列A)，或有≥1個既往治療藥物(隊列B)(表1)。結果顯示，在招募的124名MSI-H/dMMR CRC患者(A組61例，B組63例)中，隊列A中位隨訪時間為31.3個月(IQR 0.2～35.6)，ORR為33%(95%CI，21.0%～46.0%)，PFS中位數為2.3個月(95%CI，2.1～8.1)；隊列B中位隨訪時間為24.2個月(IQR 0.1～27.1)，ORR為33%(95%CI，22.0%～46.0%)，PFS中位數為4.1個月(95%CI，2.1～18.9)。兩組患者均未達到中位反應持續時間，與治療相關的3～4級不良反應發生率在隊列A中為16%(n=10)，隊列B中為13%(n=8)，其中最常見的不良反應(發生在≥2名患者中)包括胰腺炎、疲勞和丙氨酸轉氨酶升高[12]。這些研究表明，帕博利珠單抗對MSI-H/dMMR CRC患者有效，且安全性可控。

阿特珠單抗作為以PD-L1為靶點的藥物，治療CRC患者效果不佳。一項Ⅰ期臨床試驗中，研究者招募了175名晚期實體瘤患者，包括6名CRC患者，給予其3 次/周阿特珠單抗治療，給藥劑量范圍從0.01～20.00 mg/kg逐漸增加，治療耐受情況良好，CRC患者在48周時停止治療，結果顯示無明顯療效[13,21](表1)。

表1 免疫檢查點藥物治療CRC的臨床試驗

2 聯合治療

2.1 聯合放療電離輻射和放射增敏劑維利帕尼可以通過潛在的互補作用機制增強CRC患者對抗PD-1/PD-L1抗體的反應性。電離輻射可顯著增加CT26細胞系IFN-α和CXCL10的表達，維利帕尼以劑量依賴的方式增加MC38細胞系MHCⅠ和PD-L1表面定位。在兩種腫瘤模型中，同時給予維利帕尼和電離輻射治療可顯著促進抗PD-1抗體介導的延遲體內腫瘤生長作用，從而延長生存期。此外，電離輻射和維利帕尼增強抗PD-1/PD-L1抗體介導的腫瘤生長抑制會因CD8+T細胞耗竭而減弱[22]。

2.2 聯合化療奧沙利鉑(oxaliplatin，OxP)是CRC一線化療藥物，研究發現OxP在CT26-FL3小鼠中可誘導免疫原性細胞死亡，與對照組相比，原位CT26-FL3腫瘤中CD8+T細胞、CD4+T細胞和活化的DC數量增加，OxP治療的小鼠腫瘤組織中PD-L1表達升高。應用OxP及OxP聯合抗PD-L1抗體治療時，聯用組有更顯著的腫瘤抑制效果，表明OxP與抗PD-L1抗體聯用具有協同效應[23]。PD-L1抑制劑德瓦魯單抗可顯著改善CT26 CRC小鼠的存活率，通過與OxP聯用可進一步增強PD-L1抑制劑的抗腫瘤活性，并使腫瘤內HMGB1的釋放量增加[24]。PD-1/MS(MUC1和生存素)疫苗可將腫瘤抑制率從17.18%提高至30.96%，并使小鼠存活率從6.96%延長至19.44%，進一步研究顯示，PD-1/MS疫苗與OxP聯用可將腫瘤抑制率提高至74.71%[25]。

腫瘤微環境內，共表達PD-1和TIM-3的CD8+TIL被認為是功能失調細胞，TIM-3-TCF-1hi表型的TIL被認為是功能增強細胞。而FOLFOX處理的CRC小鼠模型中， CD8+TIL保持低水平的PD-1和TIM-3為特征的功能分化狀態和CD38loCD101loTIM-3-TCF-1hi細胞表型。抗PD-1抗體沒有增加腫瘤微環境內具有TIM-3-TCF-1hi表型的TIL，從而使抗PD-1抗體聯合FOLFOX化療抗腫瘤療效更優[26-27]。地西他濱誘導DNA低甲基化，可直接增加腫瘤細胞PD-L1的表達，也可改造腫瘤免疫微環境的免疫原性并促進淋巴細胞浸潤。聯合抗PD-L1抗體與OxP治療可發揮更強的抗腫瘤免疫反應，重塑腫瘤微環境，抑制腫瘤生長，為CRC患者提供潛在的臨床獲益[28]。

一項Ⅱ期臨床試驗將最初無法切除和先前未接受治療的201名mCRC患者(無論微衛星狀態如何)以1∶2的比例隨機分配，患者單獨接受多達8個周期的一線聯合化療藥物(FOLFOXIRI)/VEGF拮抗劑(貝伐單抗)，在此基礎上聯合阿特珠單抗治療，直至疾病進展，PFS為主要研究指標，該試驗正在進行中[15](表1)。

2.3 聯合免疫療法

2.3.1 聯合CTLA-4抑制劑 CTLA-4作為重要的免疫檢查點，介導腫瘤負向免疫調控。它是一種細胞內蛋白，在TCR參與并通過CD28發出共刺激信號后，被轉運到細胞表面，與CD80/86結合后，在活化的B細胞和單核細胞上傳遞抑制性信號，同時介導抑制性信號傳入T細胞，抑制T細胞的增殖和活化。臨床上應用伊匹單抗和曲美木單抗可阻斷CTLA-4的活化[6，19]。

聯合免疫檢查點阻斷的免疫療法相較單一的免疫檢查點抑制劑治療更有可能提高腫瘤患者的生存率。目前，納武利尤單抗聯合伊匹單抗已被批準用于治療惡性黑色素瘤、小細胞肺癌等。臨床研究表明，伊匹單抗和納武利尤單抗均可提高患者的無復發生存率，且聯用比單一使用納武利尤單抗療效更優，尤其在具有高突變負荷的腫瘤患者中，聯用的療效進一步增強[29-30]。dMMR/MSI-H mCRC具有突變負荷高、抗原新表位數量多、免疫檢查點表達上調等特點，臨床上采用聯合免疫檢查點阻斷的療法可使患者獲得更多益處。CheckMate 142Ⅱ期臨床試驗納入了119名CRC患者，分別給予納武利尤單抗(3 mg/kg)與伊匹單抗(1 mg/kg)，每3周給藥1次，連續4次，隨后接受納武利尤單抗(3 mg/kg)，每2周給藥1次，直至腫瘤進展、患者死亡或出現不可接受的毒副作用(表1)。在中位隨訪時間為13.4個月時，研究者評估的ORR為55% (95%CI， 45.2%～63.8%)，12周疾病控制率為80%，PFS分別為76%(9個月)和71%(12個月)，總體生存率分別為87%和85%。相較單一的納武利尤單抗治療，這一研究結果顯示納武利尤單抗與伊匹單抗聯合治療dMMR/MSI-H mCRC具有較好的安全性和顯著的臨床療效[14]。

后續深入研究顯示，在納入的119名患者中，25%、23%、19%、5%、5%和29%的患者分別經歷內分泌、胃腸道、肝臟、肺、腎臟和皮膚相關的不良反應，大多數人(57%)是1或2級不良反應，癥狀發生在早期[中位數發病時間(time to onset，TTO)5.2～12.6周]。非內分泌相關不良反應在大多數(>71%)患者中消退[中位數解決時間(time to resolution，TTR)1.5～9.0周]，使用免疫調節藥物(immune-modulating medication，IMM)改善了22%～56%患者的治療相關不良反應[31]。

2.3.2 聯合共刺激分子抑制劑 采用MC38 CRC小鼠模型進行活體成像技術和單細胞測序分析，發現CD40抑制劑可通過激活NF-κB通路使腫瘤對抗PD-1抗體治療增敏，并發現只有聯合治療的方案能取得顯著而持續的抗腫瘤作用[8]。采用CT26 CRC小鼠模型發現，抗4-1BB mIgG2a與去糖基化的抗PD-1抗體結合，治愈率達80%，而單一療法的治愈率僅為20%～25%，表明聯合治療或許可提高CRC的免疫治療效果[32]。

2.3.3 聯合溶瘤病毒 溶瘤病毒療法是使用一類具有復制能力的腫瘤殺傷型病毒，通過其連續復制最終殺滅腫瘤細胞的療法。有研究使用一種可表達CXCL11的牛痘病毒作為溶瘤病毒，發現在CRC小鼠中，相較單一使用抗PD-L1抗體，聯合療法可顯著增強療效，減輕腫瘤負荷并提高小鼠生存率[33]。研究發現，具有IL-15-IL-15Rα融合蛋白的溶瘤病毒與抗PD-1抗體的聯合使用可顯著消退CRC小鼠腫瘤，提高其存活率[34]。CSF-1R抑制劑(PLX3397)、溶瘤病毒和抗PD-1抗體的三聯組合可將免疫抑制性腫瘤微環境轉變為利于抗腫瘤免疫的微環境，顯著控制小鼠腫瘤的生長，提高小鼠存活率[35]。溶瘤病毒VSV-IFN-β(表達IFN-β的溶瘤性水皰性口炎病毒)與抗PD-L1抗體聯用可延長CT26腫瘤小鼠的PFS[36]。以上動物試驗結果提示，抗PD-1/PD-L1抗體聯合溶瘤病毒是有前景的CRC療法。

2.3.4 聯合CAR-T療法 目前，抗PD-1抗體和CAR-T等療法均未在CRC中取得理想療效，且不同免疫抑制途徑的存在可能會阻礙CAR-T細胞療法，因而，聯合治療成為一種新的思路。在一項表達抗Her-2 CAR的原代小鼠T細胞研究中，阻斷PD-1可通過增加CAR-T細胞中的重要功能參數，增強CAR-T療效[37]。另一項研究中，研究者設計了可分泌抗PD-1抗體的CAR-T組成型細胞，觀察到連續分泌抗PD-1抗體對PD-1的阻斷作用在體內外均減弱了抑制性T細胞信號轉導，增強了T細胞的增殖和效應功能，表明了二者聯合治療具有更好的效果[38]。此外，有研究表明，癌胚抗原CEA可作為CAR-T細胞治療CRC的一個良好靶點，一項針對CEA+CRC患者的Ⅰ期臨床試驗觀察到，即使在高劑量作用下，癌細胞在接受細胞療法的CEA+CRC患者中也具有良好的應答率，在大多數接受治療的患者中都觀察到較好的療效，這預示了這一靶點在治療CRC中的潛在作用，與其他類型的CAR-T細胞聯合應用可增強療效[39]。

2.4 聯合其他潛在治療手段

2.4.1 聯合靶向藥物 抗PD-1抗體納武利尤和帕博利珠的免疫治療以腫瘤微環境為目標，聯合VEGF抑制劑貝伐單抗可提高mCRC患者生存率[40]。在CRC光化學療法中，EGFR抑制劑聯合抗PD-L1抗體免疫治療具有協同作用，一定程度上防止腫瘤復發[41]。

2.4.2 聯合m6A治療 研究發現YTHDF1缺陷型小鼠與WT小鼠相比，CD8+T細胞抗腫瘤反應增強，CD8+T細胞中PD-L1表達上調。未經治療的YTHDF1缺陷型小鼠和應用抗PD-L1抗體治療的WT小鼠腫瘤消退程度僅為40%，抗PD-L1抗體處理的YTHDF1缺陷型小鼠的腫瘤消退程度可達100%。此外，腫瘤間質中低表達YTHDF1的CRC患者腫瘤活檢組織中CD8+T細胞數量常高于YTHDF1高表達的患者，提示聯合使用調控m6A相關蛋白水平的藥物和抗PD-1/PD-L1藥物或許能夠提高CRC患者腫瘤消退程度[42]。

3 結語

PD-1/PD-L1免疫療法是極具前景的腫瘤免疫療法，通過阻斷PD-1/PD-L1信號通路可使腫瘤細胞死亡，改善腫瘤患者預后。單一或聯合使用抗PD-1/PD-L1抗體都只對大部分dMMR/MSI-H mCRC患者顯示出較優療效，而對MSS型CRC患者，效果均不佳。針對該“無效人群”的有效治療離不開腫瘤免疫研究的發展，如何進一步通過聯合免疫療法提高CRC患者的療效并減少其副作用是未來研究的重要方向。