沉默MyD88抑制NF-κB p65活化對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥損傷的保護(hù)作用

王成，金衛(wèi)東，郭長(zhǎng)磊，李霞，劉振，韓明磊，侯永蘭，崔佳佳

(1.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)一科，新鄉(xiāng) 453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，新鄉(xiāng) 453000)

心血管系統(tǒng)疾病，如心力衰竭、心肌缺血再灌注損傷、冠狀動(dòng)脈微栓塞等常常伴有心肌組織炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重威脅著人們的健康及生命。TNF-α是機(jī)體內(nèi)關(guān)鍵的炎性因子，促進(jìn)心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷[1]。具體而言，心肌組織中高水平的TNF-α可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，破壞心肌組織結(jié)構(gòu)[2]。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)可激活NF-κB，引起其高表達(dá)，釋放一系列炎癥介質(zhì)，破壞心臟局部免疫平衡，最終引起炎性因子的大量釋放，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，致使心肌細(xì)胞凋亡等[3]。已有研究表明，MyD88 敲除小鼠在腎臟和心肌缺血再灌注過程中由炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的組織損傷和臟器功能紊亂明顯減輕[4]，沉默MyD88可抑制IEC-6細(xì)胞凋亡改善腸道炎癥性疾病病情[5]，故推測(cè)沉默MyD88表達(dá)可有效改善心肌炎癥。目前還沒有有關(guān)沉默MyD88對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)研究，本研究以此為切入點(diǎn)探究沉默MyD88抑制NF-κB p65活化對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑DMEM培養(yǎng)液、青-鏈霉素、FBS和胰蛋白酶，購(gòu)自Gibco公司；shRNA-MyD88慢病毒及對(duì)照慢病毒shRNA-NC，購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine, BrdU)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase MB，CK-MB)測(cè)試盒、肌紅蛋白(myohemoglobin，Mb)測(cè)試盒、肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ，cTnⅠ)測(cè)試盒、IL-1β測(cè)試盒、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)分型測(cè)試盒、IL-6測(cè)試盒和IL-10測(cè)試盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗人MyD88、Ki67、Bax、Bcl-2、c-Myc、NF-κB p65單克隆抗體，購(gòu)自Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人H9C2細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。將H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS和1 %青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d更換1次培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞的處理與分組[6]接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞于24孔板，細(xì)胞鋪底率為50%時(shí)用含10% FBS的DMEM稀釋shRNA-MyD88慢病毒和對(duì)照慢病毒，加至24孔板。于培養(yǎng)孔內(nèi)添加5 μg/mL的聚凝胺，混勻培養(yǎng)12 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后用嘌呤霉素篩選10 d，即得到穩(wěn)定感染的細(xì)胞株。將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：取穩(wěn)定感染shRNA-MyD88慢病毒的H9C2細(xì)胞，用含20 μg/L TNF-α的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，記為TNF-α+sh-MyD88組；用含20 μg/L TNF-α的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)穩(wěn)定感染對(duì)照慢病毒的H9C2細(xì)胞24 h，記為TNF-α+shRNA-NC組；用含20 μg/L TNF-α的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)未感染的H9C2細(xì)胞24 h，記為TNF-α組；以不受任何處理的H9C2細(xì)胞為Control組。

1.4 Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞MyD88及NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平用PBS漂洗各組細(xì)胞3次，再加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)水平。提取等量的蛋白樣本(20 mg)，100 ℃變性5 min。SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% BSA室溫封閉1～2 h后加入相應(yīng)的一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜孵育。次日，向PBS漂洗后樣本中加入抗IgG-HRP二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，漂洗。最后加入化學(xué)發(fā)光液后，于凝膠成像儀曝光攝片，并用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)以GAPDH為參照蛋白，操作至少獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞上清液心肌損傷因子和細(xì)胞因子水平將H9C2細(xì)胞按3×105個(gè)/mL、100 μL/孔體積加至96孔酶標(biāo)板，按1.3方法分組。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)CK-MB、Mb、cTnⅠ、IL-1β、iNOS、IL-6和IL-10水平，用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度D(450 nm)值。

1.6 FACS檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡情況收集心肌細(xì)胞懸液至10 mL離心管中，每份樣本的細(xì)胞密度為3×106個(gè)/mL(2 mL/孔)，800×g離心5 min；棄去培養(yǎng)液，用孵育緩沖液漂洗1次，800×g離心5 min；用100 μL Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，室溫條件下避光孵育10～15 min，800×g離心5 min；用孵育緩沖液漂洗細(xì)胞沉淀1次，加入熒光溶液(SA-FLOUS)4 ℃條件下孵育20 min，避光反應(yīng)并持續(xù)搖晃反應(yīng)液，F(xiàn)CM檢測(cè)并通過CytExpert軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

1.7 BrdU染色檢測(cè)各組心肌細(xì)胞增殖情況將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞傳代接種于6孔板，待細(xì)胞鋪底率達(dá)80%時(shí)，用含0.4% FBS的培養(yǎng)液孵育72 h；加入終濃度為0.03 μg/mL的BrdU繼續(xù)孵育40 min，PBS漂洗細(xì)胞3次，多聚甲醛固定10 min；嚴(yán)格按照說明書操作檢測(cè)心肌細(xì)胞增殖能力，鏡下觀察并計(jì)數(shù)BrdU染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.8 RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)基因mRNA水平TRIzol法提取H9C2細(xì)胞總RNA，用NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)定光密度[D(260 nm)/D(280 nm)]比值。按照試劑盒說明書合成cDNA并完成PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72 ℃延長(zhǎng)10 min。于4 ℃條件下保存反應(yīng)產(chǎn)物，通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白。

2 結(jié)果

2.1 沉默MyD88表達(dá)下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞MyD88蛋白表達(dá)水平Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞MyD88蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α組MyD88蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與TNF-α+shRNA-NC組相比，TNF-α+sh-MyD88組MyD88蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。(圖1)

注：1. Control組；2. TNF-α組；3. TNF-α+shRNA-NC組；4. TNF-α+sh-MyD88組。與Control組相比，*P<0.05；與TNF-α+shRNA-NC組相比，#P<0.05。圖1 沉默MyD88表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞MyD88蛋白表達(dá)水平的影響

2.2 沉默MyD88表達(dá)降低TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞上清液CK-MB、Mb及cTnⅠ水平ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞上清液CK-MB、Mb及cTnⅠ水平。結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α組CK-MB、Mb、cTnⅠ含量顯著升高(P<0.05); 與TNF-α+shRNA-NC組相比，TNF-α+sh-MyD88組CK-MB、Mb及cTnⅠ含量顯著降低(P<0.05)。(表1)

表1 沉默MyD88表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞CK-MB、Mb及cTnⅠ水平的影響

2.3 沉默MyD88表達(dá)抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡FACS檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與TNF-α+shRNA-NC組相比，TNF-α+sh-MyD88組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。(圖2)

注：A. FACS檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況；B. 各組心肌細(xì)胞凋亡率直方圖。1. Control組；2. TNF-α組；3. TNF-α+shRNA-NC組；4. TNF-α+sh-MyD88組。與Control組相比，*P<0.05；與TNF-α+shRNA-NC組相比，#P<0.05。圖2 沉默MyD88表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.4 沉默MyD88表達(dá)促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖BrdU染色檢測(cè)各組心肌細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α組BrdU染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)；與TNF-α+shRNA-NC組相比，TNF-α+sh-MyD88組BrdU染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)。(圖3)

注：A. BrdU染色檢測(cè)心肌細(xì)胞增殖情況(×200)；B. 各組BrdU染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)直方圖。1. Control組；2. TNF-α組；3. TNF-α+shRNA-NC組；4. TNF-α+sh-MyD88組。與Control組相比，*P<0.05；與TNF-α+shRNA-NC組相比，#P<0.05。圖3 沉默MyD88表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖的影響

2.5 沉默MyD88表達(dá)增加TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Ki67、c-MycmRNA水平和Bcl-2mRNA/BaxmRNA比值通過RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Ki67、Bcl-2、Bax、c-MycmRNA水平。結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α組Ki67、c-MycmRNA水平和Bcl-2 mRNA/BaxmRNA比值顯著降低(均P<0.05); 與TNF-α+shRNA-NC組相比，TNF-α+sh-MyD88組Ki67、c-MycmRNA水平和Bcl-2 mRNA/BaxmRNA比值顯著升高(均P<0.05)。(表2)

表2 沉默MyD88表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Ki67、c-Myc mRNA水平和Bcl-2mRNA/Bax mRNA比值的影響

2.6 沉默MyD88表達(dá)降低TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞IL-1β、iNOS和IL-6水平，增加IL-10水平通過ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞IL-1β、iNOS、IL-6和IL-10含量。結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α組IL-1β、iNOS、IL-6含量顯著升高(均P<0.05)； 與TNF-α+shRNA-NC組相比，TNF-α+sh-MyD88組IL-1β、iNOS、IL-6含量顯著降低(P<0.05)，IL-10含量顯著升高(P>0.05)。(表3)

表3 沉默MyD88表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞IL-1β、iNOS、IL-6和IL-10水平的影響

2.7 沉默MyD88表達(dá)降低TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞NF-κB p-p65/p65水平Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB p65磷酸化水平。結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α組p-p65/p65比值顯著升高(P<0.05)；與TNF-α+shRNA-NC組相比，TNF-α+sh-MyD88組p-p65/p65比值顯著降低(P<0.05)。(圖4)

注：1. Control組；2. TNF-α組；3. TNF-α+shRNA-NC組；4. TNF-α+sh-MyD88組。與Control組相比，*P<0.05；與TNF-α+shRNA-NC組相比，#P<0.05。圖4 沉默MyD88表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞p-p65/p65比值的影響

3 討論

MyD88作為TLR4的主要胞內(nèi)接頭蛋白，在TLR4激活引起的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TLR介導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)可使心肌遭受嚴(yán)重?fù)p傷[7]，故推測(cè)沉默MyD88表達(dá)可有效改善心肌炎癥。相關(guān)研究表明，MyD88敲除小鼠在腎臟和心肌缺血再灌注過程中能夠減少炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的組織損傷和功能紊亂[8]。同時(shí)，沉默MyD88可抑制IEC-6細(xì)胞凋亡，改善腸道炎癥性疾病[5]。本研究結(jié)果表明，TNF-α誘導(dǎo)炎癥性心肌細(xì)胞MyD88表達(dá)水平升高。

在心肌缺血再灌注損傷、心肌肥厚、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病發(fā)生過程中常常伴隨有炎癥反應(yīng)。心肌細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激后，細(xì)胞分泌炎性因子，而過量的炎性因子可引起正常細(xì)胞的損傷，從而導(dǎo)致心功能障礙[9]。TNF-α是一種心肌炎癥損傷誘導(dǎo)因子，其可誘導(dǎo)正常心肌細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞增殖活性，誘導(dǎo)心肌炎癥損傷。IL-10是抑炎因子，可通過抑制NF-κB表達(dá)減少TNF-α等炎性因子的釋放，其表達(dá)量越高，組織炎癥性損傷情況越改善[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α處理后的H9C2心肌細(xì)胞IL-1β、iNOS、IL-6、IL-10水平升高，而沉默MyD88表達(dá)則逆轉(zhuǎn)促炎因子的釋放。

CK-MB、Mb、cTnⅠ是常見的心肌損傷標(biāo)志物，在心肌損傷時(shí)會(huì)大量釋放，其含量高低用于評(píng)估心肌細(xì)胞的活力及狀態(tài)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默MyD88表達(dá)可降低TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞CK-MB、Mb、cTnⅠ水平，提示沉默MyD88表達(dá)可改善心肌損傷。

細(xì)胞凋亡也稱細(xì)胞程序性死亡，當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長(zhǎng)和凋亡的正常調(diào)控，凋亡程序發(fā)生紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞異常凋亡[12]。細(xì)胞凋亡這一過程涉及凋亡誘導(dǎo)因子和凋亡抑制因子等調(diào)節(jié)因子。其中，抗細(xì)胞凋亡成員Bcl-2可防止細(xì)胞凋亡，而促凋亡成員Bax位于線粒體外膜或細(xì)胞質(zhì)，并在應(yīng)激狀態(tài)下寡聚化，促進(jìn)線粒體釋放促凋亡因子，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[13]。Bcl-2/Bax作為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的常用指標(biāo)，其比值增加意味著凋亡被抑制，這預(yù)示著損傷心肌可得到恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默MyD88表達(dá)具有抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，升高Bcl-2 mRNA/BaxmRNA比值，提示沉默MyD88表達(dá)通過抑制細(xì)胞凋亡改善心肌損傷。

心肌炎時(shí)，心肌細(xì)胞的增殖活性會(huì)降低。Ki67是一種細(xì)胞增殖抗原，可作為細(xì)胞增殖活性評(píng)估的重要指標(biāo)之一，目前在包括心肌細(xì)胞等的研究中被廣泛應(yīng)用[14]。c-Myc是一種原癌基因，與細(xì)胞增殖周期有關(guān)，是細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)因子，能促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期[15]。當(dāng)生長(zhǎng)因子充足時(shí)，c-Myc對(duì)細(xì)胞的增殖分裂具有一定的促進(jìn)作用，可有效抑制細(xì)胞凋亡；在生長(zhǎng)因子不足的情況下，c-Myc則會(huì)抑制細(xì)胞分裂增殖及凋亡[16]。Cao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，艾塞那肽通過抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡保護(hù)心肌細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默MyD88表達(dá)具有促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的心肌炎心肌細(xì)胞增殖，升高Ki67、c-MycmRNA水平的作用，提示沉默MyD88表達(dá)通過促進(jìn)細(xì)胞增殖修復(fù)心肌損傷。

TLR/MyD88/NF-κB信號(hào)通路是機(jī)體炎癥體系中的重要通路，其廣泛存在于各種組織細(xì)胞中，在多種疾病發(fā)病及治療過程中發(fā)揮重要作用[18]。NF-κB是調(diào)控許多促炎基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞炎癥進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[19]。NF-κB存在于細(xì)胞質(zhì)中，以異源二聚體的形式存在， 主要由p65和p50組成。TLR2、4可通過MyD88途徑將刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)信號(hào)，導(dǎo)致NF-κB活化，從而啟動(dòng)多種與炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄[20]。Xu等[21]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB p65表達(dá)上調(diào)可誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，在心肌組織炎癥中表達(dá)上調(diào)。張紅利等[22]研究發(fā)現(xiàn)，參芍口服液通過抑制TLR4/MyD88依賴性信號(hào)通路抑制NF-κB的表達(dá)，繼而抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而達(dá)到保護(hù)心臟結(jié)構(gòu)及功能的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默MyD88表達(dá)具有降低p-p65/p65比值的作用，提示其可通過抑制NF-κB p65磷酸化改善心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，沉默MyD88可促進(jìn)TNF-α作用下心肌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡并抑制炎性因子釋放。這可能是通過抑制NF-κB p65的活化實(shí)現(xiàn)的。本研究只在單一細(xì)胞株中進(jìn)行初步研究，下一步計(jì)劃在原代心肌細(xì)胞及體內(nèi)進(jìn)行多方面的驗(yàn)證和分析。