血清miR-92a表達(dá)水平與胃腺癌患者無(wú)進(jìn)展生存期的關(guān)系

李秋田 翟彌彌 焦 鑫 王 玉 張 力 張國(guó)友△

(1濰坊醫(yī)學(xué)院外科學(xué)教研室，濰坊 261053；2 濰坊醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(濰坊市人民醫(yī)院)，濰坊 261031；3 濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，濰坊 261031)

胃癌(gastric carcinoma ，GC)是目前位于世界上最常見(jiàn)癌癥的第五位，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡率第三高的原因[1]。早期胃癌患者常無(wú)明顯特異性癥狀，大部分胃癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是進(jìn)展期或存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，總體 5 年生存率不足 50%[2]。

近年來(lái)，有證據(jù)表明microRNA(miRNA)在惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)[3-4]。miR-92a在多種惡性腫瘤中如肺、前列腺、直腸和胰腺等腫瘤組織細(xì)胞中呈高表達(dá)、過(guò)度表達(dá)，具有致癌作用[5]。目前關(guān)于miR-92a在胃腺癌患者血清中的表達(dá)水平及其與臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系的報(bào)道尚少。本研究擬通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)胃腺癌患者血清中miR-92a的表達(dá)情況，并分析其與胃腺癌患者臨床病理特征和生存期的關(guān)系，探討血清miR-92a是否有助于胃腺癌預(yù)后評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

胃腺癌組：2018年5月—2018年10月在濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的胃腺癌患者作為胃癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)經(jīng)病理金標(biāo)準(zhǔn)確診為胃腺癌；2)術(shù)前未行任何放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)患有其他腫瘤疾病；2)術(shù)前進(jìn)行過(guò)放化療；3)隨訪過(guò)程中失訪，有重要信息缺失。最終納入87例胃腺癌患者，其中男性47例，女性40例；年齡31～85歲，平均年齡(61.1±12.1)歲。健康對(duì)照組：選取同一時(shí)期在濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行胃鏡檢查正常的體檢者為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)為不患有胃腺癌及其他腫瘤疾病。最終納入78例健康對(duì)照，其中男性41例，女性37例，年齡35～82歲,平均年齡(62.9±11.9)歲。兩組間年齡(t=-0.961，P=0.338)、性別(χ2=0.035,P=0.851)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，且研究對(duì)象已簽署知情同意。

1.2 方法

1.2.1miR-92a檢測(cè) 所有研究對(duì)象均于清晨采集空腹外周靜脈血3～4ml于真空促凝管中，在水浴箱(37℃) 中靜置10min，使用常溫離心機(jī)3000r/min離心10min，收集上層血清約1ml到新EP管中，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。按照總RNA抽提試劑(Trizol試劑)說(shuō)明書(shū)提取總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)量提取的RNA樣品的純度，使其OD260/OD280的比值在1.8～2.1之間。提取總RNA在-80℃的條件下保存，以備后續(xù)的實(shí)驗(yàn)使用。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，反應(yīng)體系：RNA引物混合物13μl，5×RT Reaction Buffer 4μl，RNaseinhibitor 1μl，dNTP 1μl，M-MLV RTase 1μl，ddH2O 5μl，將cDNA樣本置于-20℃環(huán)境中保存。miR-92a正向引物為5’-AGCTCTACGACTGTCACTCG-3’，反向引物為5’-GTATGCATTCTATCGTAG-3’；內(nèi)參正向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’， 內(nèi)參反向引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系以U6為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系為：2×All-in-oneTM qPCR Mix 10μl，cDNA模板2μl，正向引物2μl，反向引物2μl，50×Rox Reference Dye0.4μl，ddH2O(RNase/DNase free) 3.6μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸10s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.2miR-92a表達(dá)水平判定 采用2ΔΔCt法計(jì)算血清miR-92a的表達(dá)情況：ΔΔCt=(CtmiR-92a-CtU6)待測(cè)樣本-(CtmiR-92a-CtU6)對(duì)照組。循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct值)為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.2.3隨訪與觀察指標(biāo) 采用前瞻性研究方法對(duì)胃腺癌患者進(jìn)行隨訪，以無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)作為療效評(píng)價(jià)指標(biāo)。PFS定義為術(shù)后第1天起，未發(fā)生復(fù)發(fā)、原發(fā)器官腫瘤轉(zhuǎn)移及其他原因引起死亡的時(shí)間。

早期胃癌每6個(gè)月隨訪1次，進(jìn)展期胃癌每3個(gè)月隨訪1次，隨訪起始時(shí)間自患者術(shù)后第1天開(kāi)始，通過(guò)電話或門(mén)診等方式對(duì)患者進(jìn)行調(diào)查，隨訪時(shí)長(zhǎng)為2年。隨訪內(nèi)容包括擴(kuò)患者完整的臨床資料、體格檢查、血液學(xué)檢查、體重監(jiān)測(cè)、影像學(xué)檢查或內(nèi)鏡檢查等資料。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-92a表達(dá)水平

胃腺癌患者血清miR-92a相對(duì)表達(dá)量(3.378±1.031)高于健康對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量(1.062±0.117)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.720，P<0.001)。

2.2 miR-92a表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

血清miR-92a的表達(dá)水平與胃腺癌患者的性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度無(wú)明顯關(guān)系，而與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移臨床分期等臨床病理特征關(guān)系密切，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.3 血清miR-92a表達(dá)水平和胃腺癌患者無(wú)進(jìn)展生存期的關(guān)系

根據(jù)既往研究及參考文獻(xiàn)，以所有胃癌患者血清中miR-92a表達(dá)量的平均值3.378為界限，將血清miR-92a表達(dá)量≥3.378胃腺癌患者納入高表達(dá)組，將血清miR-92a表達(dá)量<3.378胃腺癌患者納入低表達(dá)組。miR-92a高表達(dá)組55例，低表達(dá)組32例。Kaplan-Meier生存曲線分析血清miR-92a表達(dá)水平的高低和胃腺癌患者生存期的相關(guān)性，胃腺癌患者血清miR-92a高表達(dá)組中位無(wú)進(jìn)展生存期(15個(gè)月)低于miR-92a低表達(dá)組(23個(gè)月)。兩組患者的生存曲線存在顯著差異(χ2=9.06，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

表1 不同特征胃腺癌患者miRNA-92a相對(duì)表達(dá)量的比較

圖1 miR-92a表達(dá)與無(wú)進(jìn)展生存期的關(guān)系

2.4 血清miR-92a不同表達(dá)水平胃腺癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)

隨訪結(jié)束時(shí)，miR-92a高表達(dá)組死亡10例，生存45例，miR-92a低表達(dá)組死亡3例，生存29例。血清miR-92a高表達(dá)組的死亡風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)組的1.97倍(HR=1.97，P<0.05)。

3 討論

胃癌作為全球第三大癌癥死亡原因，早發(fā)現(xiàn)、早治療是降低其死亡率的關(guān)鍵。既往由于缺乏高度敏感和無(wú)創(chuàng)性的診斷生物標(biāo)志物，胃癌的死亡率居高不下。miRNA功能異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是腫瘤一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制。miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約為20～24個(gè)核苷酸的具有高度物種保守性的內(nèi)源性非編碼小RNA，miRNA在細(xì)胞早期發(fā)育，增殖，分化、死亡以及脂肪代謝等生命進(jìn)程中起著關(guān)鍵性的作用[6-9]。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中表現(xiàn)為癌基因或抑癌基因，通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和侵襲等調(diào)控腫瘤的生物學(xué)行為[4]。因此，miRNA的出現(xiàn)為胃癌早期篩查提供了更多的可能。miRNAs可以通過(guò)分泌胞外體顆粒從癌細(xì)胞釋放到體液中，這可以保護(hù)它們?cè)谘h(huán)中不被RNase降解。在血清、血漿、尿液、淚液、羊水和胃液中可檢測(cè)到多種miRNA[10-11]。Ueda等[12]報(bào)告低表達(dá)let-7g、miR-433和miR-214的高表達(dá)與低生存率相關(guān)，與臨床相關(guān)變量無(wú)關(guān)，包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期。Li等[13]用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)分析了100例胃癌患者的7種miRNAs表達(dá)譜，結(jié)果表明7種miRNAs可以預(yù)測(cè)胃癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)和總生存率。因此，miRNAs可用于判斷胃癌患者的預(yù)后，預(yù)測(cè)胃癌患者的生存率和復(fù)發(fā)率。

miR-92a家族是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型miRNA，目前研究認(rèn)為，miR-92a家族基因與血管內(nèi)皮細(xì)胞形成有關(guān)[14]，其表達(dá)紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-92a在多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，具有致癌作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-92a在肺、胃、前列腺、直腸和胰腺等腫瘤組織細(xì)胞中呈高表達(dá)[5]。Shigoka等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-92a在肝癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，但在肝細(xì)胞癌周?chē)姆前┬愿渭?xì)胞中未檢測(cè)到miR-92a表達(dá)，其表達(dá)程度與患者的年齡、性別、病毒類(lèi)型、臨床分期和腫瘤分化無(wú)關(guān)。Motawi等[16]研究表明，與對(duì)照組相比，膀胱癌患者中miR-92a，miR-100和miR-143的定量表達(dá)水平顯著降低，且這3種miRNA的表達(dá)水平與年齡、膽道疾病、TNM分期和等級(jí)之間均無(wú)相關(guān)性。Wu等[17]研究表明，基于糞便的miRNA具有良好的穩(wěn)定性和高度可重復(fù)的檢測(cè)性，與正常對(duì)照組相比，結(jié)直腸癌患者中的糞便miR-92a水平過(guò)表達(dá)。此外，糞便miR-92a水平對(duì)遠(yuǎn)端結(jié)直腸癌的敏感性高于近端結(jié)直腸癌。切除腫瘤或晚期腺瘤導(dǎo)致糞便miR-92a水平降低。Chen[18]等研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者癌組織中miR-92a的高表達(dá)可以促進(jìn)食管鱗癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并預(yù)示食管鱗癌患者的生存期較短。

為分析miR-92a與胃腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 手段檢測(cè)出胃腺癌患者與健康者中血清miR-92a的Ct值，發(fā)現(xiàn)miR-92a在胃腺癌患者血清中表達(dá)明顯升高。通過(guò)研究miR-RNA與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示血清miR-92a與胃腺癌患者的發(fā)病年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期等臨床病理特征密切相關(guān)，推測(cè)血清miR-92a的高表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致胃腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

Kaplan-Meier生存分析示血清miR-92a高表達(dá)組胃腺癌患者無(wú)進(jìn)展生存期短于miR-92a低表達(dá)組，說(shuō)明血清miR-92a高表達(dá)胃腺癌患者預(yù)后更差。Log-rank檢驗(yàn)示，兩組患者的生存曲線存在顯著差異，且血清miR-92a高表達(dá)組胃腺癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)更高，是低表達(dá)組的1.97倍。

綜上所述，血清miR-92a水平成為胃癌判斷預(yù)后的標(biāo)志物之一，尚需進(jìn)一步開(kāi)展大樣本的縱向研究確定其臨床價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)病例數(shù)尚少，血清中miR-92a濃度低，miRNAs檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化和診斷閾值的確定仍是本次實(shí)驗(yàn)的難題,因此應(yīng)在下一步的研究中擴(kuò)充樣本量，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)。此外，miR-92a在胃癌發(fā)生發(fā)展中的具體的生物學(xué)機(jī)制尚不完全清楚，因此在下一步的研究中應(yīng)尋找miR-92a在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中的靶向調(diào)控機(jī)制，為miR-92a作為胃癌的早期診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)提供理論依據(jù)。