HPLC-DAD法評價青錢茶對α-葡萄糖苷酶的抑制活性*

張 勇 高桂花

(濟寧醫學院藥學院，日照 276826)

α-葡萄糖苷酶能催化α-1,4-糖苷鍵水解，使小腸內麥芽糖、蔗糖等寡糖水解。通過抑制該酶的活性，可減緩葡萄糖的生成及吸收，調整血糖水平。青錢茶是青錢柳葉、黃芪、山藥及綠茶制成的泡茶飲，具有降糖作用。其降糖機制可能為競爭性抑制α-葡萄糖苷酶，故評價其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性具有十分重要的意義。

目前關于α-葡萄糖苷酶抑制劑體外評價方法主要采用紫外分光光度法[1-2]。但當抑制劑本身在測定波長下具有紫外吸收時，會對測定產生干擾，影響結果的準確度。本實驗采用高效液相色譜法-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)法，將干擾物質與產物分離后[3-4]，對產物進行準確測定，從而達到精準評價α-葡萄糖苷酶抑制劑活性的目的。現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津)；BP211D電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；KQ-500DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；酸度計(上海精密科學儀器有限公司)；臺式高速離心機(湘儀儀器廠)。

1.2 試藥

α-葡萄糖苷酶(北京百靈威科技有限公司)；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)(北京百靈威科技有限公司，純度98%)；對硝基酚(PNP)(北京百靈威科技有限公司，純度99%)；米格列醇(山東西亞化學工業有限公司，純度≥98%)；乙腈(色譜純，Burdick & Jackson)；青錢茶(江西省修水神茶實業有限公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 試液的制備

1)0.1mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)。精密稱取0.68g磷酸二氫鉀和0.705g磷酸氫二鈉置100ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2)2.5mmol·L-1PNPG溶液。精密稱取PNPG 18.81mg，置25ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。現用現配。

3)1U·ml-1α-葡萄糖苷酶溶液。精密稱取α-葡萄糖苷酶100U，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。于冰箱中冷藏保存。

4)0.2mol·L-1反應終止液。精密稱取無水碳酸鈉0.216g，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

5)5mmol·L-1PNP對照品溶液。精密稱取PNP 17.42mg，置25ml容量瓶中，加磷酸鹽緩沖液溶解至刻度，搖勻。

2.2 供試品溶液的制備

1)青錢茶提取物。取青錢茶3.0g，加沸水250ml，室溫浸泡15min，濾過，再同法浸泡兩次，濾液濃縮，蒸干，即得。

2)青錢茶供試品溶液。取青錢茶水提取物適量，溶于磷酸鹽緩沖液中，得青錢茶供試品溶液。

3)米格列醇供試品溶液。取米格列醇適量，溶于磷酸鹽緩沖液中，得米格列醇供試品溶液。

2.3 α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗

α-葡萄糖苷酶抑制劑體外活性篩選是以PNPG作為底物，PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下可分解產生PNP，以PNP作為檢測物評價α-葡萄糖苷酶抑制劑的活性[5-8]，按照表1取PBS、α-糖苷酶試液，米格列醇供試品溶液及青錢茶供試品溶液，混勻，37℃孵育10min。再分別加入PNPG溶液，混勻，37℃反應90min后，加反應終止液混勻，終止反應，制得空白對照溶液、陽性對照溶液及樣品溶液。采用高效液相色譜法測定生成的PNP，按下式計算抑制率。

表1 反應液體積/μl

2.4 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18(2)柱(200×4.6mm，5.0μm)；流動相：0.3%乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序為0～25min，10%～90% B；25～27min，90%～10% B；27～35min，10% B；流速1ml·min-1；柱溫35℃；檢測波長為315nm；進樣量10μl。

2.5 含量測定方法學驗證

2.5.1專屬性試驗 取樣品溶液、陽性對照溶液及空白對照溶液各10μl，按“2.4”項下色譜條件進樣分析。結果顯示，空白對照、PNPG及雜質均不干擾PNP的測定。色譜圖見圖1。

注：Ⅰ-樣品溶液；Ⅱ-陽性對照溶液；Ⅲ-空白對照溶液

2.5.2線性關系考察 取PNP溶液，逐級稀釋制成17.42、34.84、69.68、139.36、348.4μg·ml-1的溶液。經0.45μm濾膜過濾后，進樣10μl。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算回歸方程。結果PNP在17.42～348.4μg·ml-1范圍內線性良好，回歸方程為Y=5299920X+593618(r=0.9997)。

2.5.3精密度試驗 取PNP標準溶液，按“2.4”項下色譜條件，連續進樣6次，記錄峰面積，結果，PNP峰面積RSD為0.52%，表明儀器精密度良好。

2.5.4穩定性試驗 取同一份青錢茶樣品溶液，按“2.4”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10h進樣，記錄峰面積，結果PNP峰面積RSD為0.6%，表明對照品溶液在10h內穩定性良好。

2.5.5檢測限和定量限 取PNP對照品溶液，逐級稀釋，制備對照品溶液進樣10μl，以S/N=3∶1時PNP的質量為檢測限，S/N=10∶1時PNP的質量為定量限。結果PNP的檢測限為0.1ng，定量限為0.2ng。

2.5.6加樣回收率及重復性試驗 取青錢茶提取物50.12mg，置10ml容量瓶中，加磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度，得5.012mg·ml-1的青錢茶提取物溶液。分別取青錢茶提取物溶液25、25、25μl，PNP溶液11、14、17μl，PBS溶液14、11、8μl混勻作為供試品溶液，按照“2.3”方法制備抑制樣品溶液，每個水平平行3份。按“2.4”項下色譜條件，測定PNP濃度，計算回收率，結果見表2，平均回收率為98.8%，RSD為1.5%。

取上述青錢茶提取物溶液25μl、PBS溶液25μl混合作為重復性供試品溶液，平行6份，按“2.3”項下方法制備抑制樣品溶液，按“2.4”項下色譜條件，測定PNP濃度，計算抑制率。青錢茶提取物的抑制率重復性試驗的RSD為1.9%，表明方法重復性良好。

表2 回收率試驗結果(n=9)

2.6 樣品測定

精密稱取米格列醇及青錢茶提取物，按“2.3”項下方法制備抑制樣品溶液，按“2.4”項下色譜條件進樣測定，結果表明青錢茶提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用，且具有濃度依賴性。見表3。

表3 樣品測定結果(n=3)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本實驗采用液相色譜法測定PNP的優勢在于經色譜柱分離后，中藥提取物中組分不再干擾PNP的測定。鑒于青錢茶提取物中成分較多，采用梯度洗脫方式，以確保PNP測定不受干擾。分別考察了甲醇與乙腈作為有機相時的分離情況，在保留時間相近的情況下，使用乙腈時分離效果更好。添加乙酸能夠改善峰形，減小拖尾。

3.2 酶促反應時間的優化

按照2.3確定的條件，以青錢茶提取物為抑制劑，分別在30、50、70、90、110、130min加入反應終止液終止反應，測定產物PNP的變化。結果在90min時PNP的產量已經足夠，適宜高效液相色譜儀測定，確定反應時間為90min。

3.3 青錢茶α糖苷酶抑制活性

米格列醇是一種高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑，對各種α-葡萄糖苷酶均有較強的抑制作用，尤其是對蔗糖酶和葡萄糖淀粉酶有更強的抑制作用。青錢柳葉其主要功能性成分為黃酮、多糖及三萜等類物質[9-12]，由青錢茶α-糖苷酶抑制活性實驗結果可知，青錢茶提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用具有濃度依賴性，等量10mg·ml-1的青錢茶提取物與2.5mg·ml-1的米格列醇的體外抑制作用相當，其IC50為1.7mg·ml-1。

綜上所述，本文采用HPLC法成功將干擾物質與PNP分離，并準確測定PNP的含量，所建立的方法定量準確，操作簡便，能夠用于精準評價青錢茶對α-糖苷酶的抑制活性。同時，實驗結果表明，青錢茶具有顯著的抑制α-糖苷酶活性的能力，其抑制作用具有濃度依賴性，這為青錢茶進一步開發和利用提供了一定的依據。