三七總皂苷對人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響*

隨蓓蓓 李華舜 孟 曉 孫秀玲 劉 莉

(濟寧醫學院生物科學學院,日照 276826)

三七，別名田七，我國主要生產地為云南、廣西等地[1]。三七主要通過其含有的皂苷類物質發揮藥用作用[2]。三七總皂苷大多數可分為達瑪烷型的20(S)-原人參二醇和20(S)-原人參三醇2種類型[3]。有研究發現，三七總皂苷能抑制癌細胞增殖、生長、促進癌細胞凋亡[4]。常規化療手段與三七總皂苷聯合使用既能降低化療手段的副作用又可發揮抗腫瘤的療效，在臨床治療中對延長患者生存期有重要意義[5]。因此，三七總皂苷對腫瘤治療有十分重要的臨床意義，值得深入研究。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌MDA-MB-231細胞(ATCC)購自上海研生生化試劑有限公司；FBS和DMEM為Gibco產品；三七總皂苷為實驗室自提取；細胞凋亡試劑盒和Casepase 3活性檢測試劑盒為碧云天產品。人乳腺癌細胞MDA-MB-231使用含FBS 10%的高糖DMEM培養基，37℃、5% CO2條件下進行傳代培養。

1.2 方法

1.2.1人乳腺癌細胞MDA-MB-231的活性檢測 將細胞接種于96孔板，待鋪滿細胞培養板80%時開始處理。分別設空白對照組及不同濃度的三七總皂苷處理組。空白對照組加入DMEM培養基，三七總皂苷處理組分別加入終濃度含0.5、1.0、2.0mg/ml三七總皂苷的DMEM培養基。每組每個時間段設置3個平行孔。取出96孔板，將每個待測孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5% MTT)，37℃、5% CO2孵育4h。終止孵育，棄去孔內溶液，加入適量PBS，清洗兩次。每孔精確加入DMSO 150μl，低速振蕩10min，酶標儀490nm波長下檢測各孔的吸光值。以平均吸光值為縱坐標，以時間為橫坐標，繪制人乳腺癌細胞MDA-MB-231的吸光值曲線。

1.2.2人乳腺癌MDA-MB-231細胞的光鏡觀察 將細胞接種于6孔板，待細胞鋪滿80%的時候。同上設置空白對照組和實驗組，實驗組分別加入0.5、1.0和2.0mg/ml三七總皂苷，置于二氧化碳培養箱中繼續培養24h。用0.25%的胰酶消化不同濃度三七總皂苷處理過的MDA-MB-231，吹打至均勻，1000r/min，離心5min，棄上清。將沉淀的細胞與臺盼藍染液(9∶1)混合均勻。將混合液1000r/min，離心5min，棄上清液，加PBS清洗，再次離心，棄上清。重復3次，至細胞清洗干凈。將細胞沉淀加入適量PBS制成細胞懸液，滴在載玻片上，制成標本，置于顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3人乳腺癌MDA-MB-231細胞的凋亡檢測 將細胞接種于6孔板內，待細胞鋪滿80%，同上設置空白對照組和實驗組。實驗組分別加入0.5、1.0和2.0mg/ml三七總皂苷，吸盡培養液，每孔加入0.5ml固定液，固定30min。棄去固定液，用適量PBS清洗兩次，每次2min。每孔加入0.5ml染液，晃動染色5min。棄去染液，加入適量PBS， 晃動清洗兩遍，每次2min。加入抗熒光淬滅劑，置于熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4Casepase3酶活檢測 分別加入0.5、1.0、2.0mg/ml濃度的三七皂苷處理12h后，將空白對照組和實驗組細胞600r/min，4℃離心5min收集細胞，PBS洗滌1次。按照每200萬細胞加入100μm裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15min。然后，15000r/min，4℃離心10min。將上清轉移到冰浴預冷的離心管中，-70℃保存樣品。取出適量的Ac-DEVD-pNA(2mM)，置于冰浴上備用。如表1配制反應體系，加入Ac-DEVD-pNA(2mM)后混勻，37℃孵育1h。酶標儀檢測樣品A405吸光度，利用pNA濃度相對于A405的標準曲線，y=0.0025x，R2=0.99，求取樣品pNA濃度。一個酶活力單位定義為當底物飽和時，在37℃ 1h內可以剪切1nmol Ac-DEVD-產生pNA1nmol pNA的caspase 3的酶量，由此計算出樣品中含有多少個酶活力單位的caspase 3。

表1 反應體系

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組人乳腺癌MDA-MB-231細胞活性變化情況

在0.5～2mg/ml三七總皂苷處理后，人乳腺癌MDA-MB-231細胞的吸光度值隨著濃度升高和作用時間延長而不斷降低，具有時間和濃度依賴性。見圖1。

圖1 MDA-MB-231的活性檢測曲線

2.2 各組人乳腺癌MDA-MB-231細胞光鏡觀察結果

空白對照組細胞形態為圓形或卵圓形且大小均一，細胞膜表面光滑。0.5mg/ml三七總皂苷組細胞產生了輕微的空泡化。1mg/ml三七總皂苷組細胞形態改變、結構紊亂，且細胞膜邊緣出現大量的凋亡小體。2mg/ml三七總皂苷組細胞形態改變、結構紊亂、出現大量的凋亡小體和細胞碎片。見圖2。

注：A.空白對照組,24h；B.0.5mg/ml三七總苷組,24h；C.1.0mg/ml三七總苷組,24h；D.2.0mg/ml三七總苷組,24h;標尺=50μm

2.3 各組人乳腺癌MDA-MB-231細胞的凋亡情況

空白對照組細胞核形態正常，熒光強度均一，相對較弱。0.5mg/ml三七總皂苷組細胞核形態，與空白對照組相比，變化不明顯。1.0mg/ml三七總皂苷組細胞核，形態改變、固縮變小，有的甚至呈碎塊狀，熒光強度變強。2.0mg/ml三七總皂苷組細胞核，亦出現了形態改變、固縮變小、結構紊亂，熒光增強的特征。見圖3。

注：A.空白對照組,12h；B.0.5mg/ml三七總苷組,12h；C.1.0mg/ml三七總苷組,12h；D.2.0mg/ml三七總苷組,12h;標尺=20μm

2.4 各組Casepase3酶活力變化情況

0.5、1.0和2.0mg/ml三七總皂苷處理人乳腺癌MDA-MB-231細胞12h后，Casepase 3酶活力不斷提高，與濃度呈正相關。與空白對照組相比，Casepase 3酶活力增加顯著，差異具有統計學意義(P<0.05)。

注：與空白對照組相比，*P<0.05；**P<0.01

3 討論

現代生活中，乳腺癌是女性中常見的一種疾病，患者人數逐年攀升，已成為困擾我國女性健康的重大疾病之一[6-7]。化療、放療等常規治療手段對機體的毒副作用嚴重，尋求高效、低毒的新型抗癌藥物，成為當前國內外研究的熱點。三七總皂苷作為天然藥物，來源廣泛，對正常的細胞毒性較低，能抑制多種癌細胞的增殖，具有誘導凋亡的作用。三七總皂苷與常規化療手段聯合使用，對改善臨床患者的生存質量，發揮著重要作用。研究表明，三七總皂苷對肝癌細胞SMMC-7721和白血病NB4細胞的增殖均有直接的抑制作用，且隨著藥物濃度增加，抑制作用增強，有藥物濃度依賴性[8-9]。三七總皂苷處理白血病HL-60細胞后，細胞出現凋亡，說明三七總皂苷有促進細胞凋亡的作用，且這種作用隨藥物濃度增大而增加[10]。本文結果顯示，與空白對照組相比，濃度為0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml三七總皂苷可降低人乳腺癌MDA-MB-231細胞的活性，且具有時間和濃度依賴性； Casepase 3酶活力增加顯著，差異具有統計學意義，說明三七總皂苷能有效抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖和活性，并具有促凋亡作用。此實驗結果可為乳腺癌臨床相關治療提供用藥參考，也為三七總皂苷基礎研究提供數據支持。