患病龍蝦病原檢測及藥敏試驗

○姚方艷

2020年，我縣歸仁鎮(zhèn)3個塘口的養(yǎng)殖戶龍蝦塘口出現(xiàn)了死亡的現(xiàn)象，病蝦主要表現(xiàn)為頭胸甲易剝離、螯肢及附肢無力、反應(yīng)遲鈍、應(yīng)激能力較弱，在頭胸甲部位常出現(xiàn)白斑。筆者通過對病蝦肝胰腺的細(xì)菌分離及鑒定和對蝦鰓的白斑病毒的提取及PCR法分子檢測技術(shù)來探討引起小龍蝦發(fā)病的原因。

1 方法

1.1 病原菌的分離、鑒定及藥敏試驗

（1）病原菌的分離：用滅菌棉簽蘸取小龍蝦肝胰腺，均勻涂于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上和TCBS培養(yǎng)基上，分別置于28℃、37℃恒溫培養(yǎng)18-24h后，觀察菌落形態(tài)，并挑取可疑單個菌落劃線接種在營養(yǎng)瓊脂平板和3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，分別置于28℃、37℃恒溫培養(yǎng)18-24h。

（2）細(xì)菌的鑒定：把分離出的細(xì)菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司，利用細(xì)菌16SrDNA序列測序的方法對細(xì)菌進行種屬鑒定。

（3）藥敏試驗：挑取單菌落于5mL生理鹽水中制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海ˋ管），從中吸取0.1mL，加入到10mL無菌生理鹽水中混勻（B管）。利用微量移液器吸取B液，加入藥敏板所有的微孔中，每孔0.1mL，分別測定細(xì)菌分離株對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶鈉共7種常見藥物的敏感程度。蓋好試劑板，置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24h，經(jīng)肉眼觀察證實無細(xì)菌生長試管中的最低藥物濃度，即為藥物的最小抑菌濃度。

1.2 WSSV核酸提取及檢測：

從病蝦中取約100 mg鰓組織，按照生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒的說明進行DNA提取，對WSSV DNA樣本采用《GB/T 28630.2-2012白斑綜合征（WSD）診斷規(guī)程第2部分套式PCR檢測法》為標(biāo)準(zhǔn)進行檢測。PCR擴增體系總量為50μL，分別為：25μL Mix Taq酶（Takara），18μL 無菌水，1 μL 正向引物，1 μL反向引物，5 μL模板。PCR產(chǎn)物通過用50×TAE電泳緩沖液配制的1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 病原菌鑒定

通過細(xì)菌16SrDNA序列測序的方法對從病蝦肝胰腺分離出的細(xì)菌進行種屬鑒定結(jié)果為腸棕氣單胞菌、最小弧菌和霍亂弧菌。

2.2 病原菌的藥敏試驗結(jié)果

3株細(xì)菌對7種抗菌藥物的最小抑菌濃度如下表所示。

參照2013年抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，腸棕氣單胞菌、最小弧菌、霍亂弧菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹均敏感，對磺胺間甲氧嘧啶鈉耐藥。

3株細(xì)菌對7種抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC）對照表（單位：μg/mL）：

2.3 WSSV PCR檢測結(jié)果

PCR檢測結(jié)果顯示病蝦WSSV病毒陽性檢出率為100%，如下圖所示。

WSSV PCR檢測結(jié)果

M：DNA Marker（自上到下依次為2000、1000、750、500、250、100bp）；1.陽性對照；2.陰性對照；3.采樣編號SH20052601；4.采樣編號4SH2005260202；5.采樣編號SH20052603

3 討論與分析

從發(fā)病小龍蝦肝胰腺分離到的3個細(xì)菌，通過細(xì)菌16SrDNA序列測序的方法，確定為腸棕氣單胞菌、最小弧菌和霍亂弧菌。通過藥敏試驗表明三種細(xì)菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹均敏感，對磺胺間甲氧嘧啶鈉耐藥。

PCR結(jié)果表明生病小龍蝦中都感染了WSSV（白斑綜合征病毒），目前尚無有效的治療藥物。在養(yǎng)殖過程中如果出現(xiàn)死蝦，在遠離養(yǎng)殖塘處掩埋病蝦，及時售賣池塘中的龍蝦，既可降低養(yǎng)殖密度，也可以降低損失；對于捕到地籠里的龍蝦不可回塘。

資金項目：江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（克氏原螯蝦）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（JATS〔2020〕297）

（通聯(lián)：223953，江蘇省泗洪縣歸仁鎮(zhèn)政府 手機：15161233108）