lncRNA CASC9和miR?758?3p在肝細胞肝癌血清中的表達及診斷價值

陸秀琴 葛國洪 潘洪秋 王健

1上海健康醫學院（上海201318）；2鎮江市第三人民醫院肝病科（江蘇鎮江212021）；3上海交通大學醫學院附屬新華醫院移植科（上海200082）

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是高度致命的惡性腫瘤，是全世界與癌癥相關死亡的第四大原因［1］，且其發病率還在呈增加的趨勢［2］。由于早期缺乏特異性的臨床癥狀，大多數HCC患者確診時已處于晚期，錯過了進行根治性治療的最佳時機，這類患者即使積極進行了各種治療，其總體的預后情況依然很差［3］。目前檢測血清中甲胎蛋白（α?fetoprotein，AFP）的表達是HCC早期篩查的重要方法，但是分化成熟的肝細胞增生也可合成AFP，AFP 在肝硬化、肝炎等肝臟損傷所致肝細胞代償性增生的情況下會分泌增多，因此AFP 對HCC 的診斷價值還有待進一步提升［4］。研究報道長鏈非編碼RNA 腫瘤易感候選者9（long non?coding RNA cancer susceptibility candidate 9，lncRNA CASC9）在HCC 患者血清中高表達與患者不良病理分期相關［5］。長鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，lncRNA）調控惡性腫瘤進展的重要分子機制是作為微小RNA（microRNA，miRNA）的內源競爭RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）發揮重要作用［6］。HU 等［7］報道在卵巢癌中lncRNA CASC9 通過抑制miR?758?3p 的水平促進卵巢癌的生長。研究報道miR?758?3p 可以抑制HCC 患者細胞的增殖、遷移和侵襲能力［8］。從肥胖到代謝綜合癥的進展過程中，miR?758?3p 具有作為一種基于血液的生物標記物的潛力［9］。而miR?758?3p 在HCC 患者血清中表達的意義未知。本研究旨在分析HCC 患者血清中lncRNA CASC9 和miR?758?3p的表達及其與患者臨床病理特征的關系，并探討了兩者聯合AFP 能否提高對HCC 早期診斷價值，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2018年6月至2020年2月于鎮江市第三人民醫院行手術治療或者穿刺診斷的HCC 患者72 例，將其納入到HCC 組。納入標準：（1）入組前未經放化療或者靶向等治療，術后或者穿刺病理確診為HCC；（2）臨床資料完整；（3）患者對本次研究內容知情同意。排除標準：（1）合并有肺癌、卵巢癌等其他惡性腫瘤者；（2）合并自身免疫性疾病、血液系統疾病者；（3）妊娠或哺乳期婦女。患者年齡33～79歲，平均年齡（56.62±15.30）歲，＞56 歲者40 例，≤56 歲者32 例；男49 例，女23 例；腫瘤大小：＞5 cm 26 例，≤5 cm 46 例；肝硬化：有46 例，無26 例；淋巴結轉移20 例，無淋巴結轉移52例；TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期20例，Ⅲ期16例，Ⅳ期9 例；血清AFP（ng/mL）：＞200 為41 例，≤200為31 例。

選擇同期于我院行健康體檢人員30 例作為健康對照組，年齡28～72 歲，平均（55.08 ± 16.88）歲。男18 例，女12 例。所有患者均簽署書面知情同意書，本研究已得到我院倫理審查委員會的批準，且遵循赫爾辛基宣言。

1.2 實驗試劑與儀器無RNA 酶PCR 管、EP 管和槍頭等購于美國KIRGEN 公司；血清RNA 提取試劑盒購于德國QIAGEN 公司；DEPC 水購于北京索萊寶試劑公司；lncRNA CASC9、miR?758?3p 和內參U6 引物購于美國invitrogen 公司；ULtraRT one step RT?PCR 試劑盒購自北京百奧萊博；Nanodrop2000購于美國Thermo 公司；7500 熒光定量PCR 儀購于美國BIO?RAD 公司。

1.3 實時定量聚合酶鏈式反應（real?time quanti?tative polymerase chain reaction，qRT?PCR）抽取納入研究患者的靜脈血4 mL，室溫靜置2 h 左右至血液完全凝固及分層后，以2 500 r/min 離心10 min。可見液體分為兩層，將上層上清液1 mL左右吸至EP 管中，放于液氮中保存備用。將收集的血清加至QIAzol 裂解液中溶解，加入氯仿溶液，混勻后低溫高速離心30 min，可見液體分成水相和有機相。RNA 位于上層水相，將上層上清液移至新的EP 管中，加入無水乙醇后經RNeasy MinElute離心柱過濾、DEPC 水洗脫后獲得血清中總RNA。采用Nanodrop2000 測得RNA 濃度，放于-80 ℃冰箱中保存備用。

按照ULtraRT one step RT?PCR 試劑盒說明書進行試劑的配制，RNA 質量為1 μg（按照濃度計算體積）、2×Ultra RT one step Buffer 12.5 μL、上下游引物各1 μL、Ultra RT one step EnzymeMix 0.5 μL、無RNA 酶的雙蒸水補足25 μL。45 ℃30 min 進行反轉錄反應，95 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，變性退火延伸共40個循環，終延伸72 ℃5 min。采用2?ΔΔCt法以GAP?DH 基因為內參計算lncRNA CASC9 和miR?758?3p的相對表達量。

lncRNA CASC9 引物F：5′?TTGGTCAGCCACA?TTCATGGT?3′，R：5′?AGTGCCAATGACTCTCCAGC?3′，以GAPDH 為內參，GAPDH 引物F：5′?GCACC?GTCAAGGCTGAGAAC?3′，R：5′?TGGTGAAGACGC?CAGTGGA?3′；miR?758?3p 引物F：5′?ACACTCCAG?CTGGGTTTGTGACCTGGTCCA?3′，R：5′?CTCAACT?GGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTTAG?TG?3′，以U6 為內參，U6 引物F：5′?CTCGCTTCGGC?AGCACA?3′，R：5′?AACGCTTCACGAATTTGCGT?3′。

1.4 統計學方法使用SPSS 23.0進行研究資料分析。觀測資料主要為計量數據，以（）描述。兩組間的比較為成組t檢驗或校正t檢驗。基線資料中的計數資料以例（%）描述。兩組間比較為χ2檢驗。ROC 曲線分析診斷價值。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA CASC9 和miR?758?3p 的結合位點預測采用starBase v2.0 在線軟件（https：//bigd.big.ac.cn/databasecommons/database）預 測lncRNA CASC9與miR?758?3p 的結合位點，結果顯示lncRNA CASC9 與miR?758?3p 存在潛在的互補結合位點，見圖1。

圖1 StarBase v2.0 在線軟件預測lncRNA CASC9 與miR?758?3p 的結合位點Fig.1 StarBase v2.0 online software predicts the binding sites of lncRNA CASC9 and miR?758?3p

2.2 lncRNA CASC9和miR?758?3p在HCC血清中的表達與健康對照組相比，lncRNA CASC9在HCC組血清中的表達顯著增加（P＜0.05），miR?758?3p在HCC組血清中的表達顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 兩組血清中lncRNA CASC9、miR?758?3p 表達水平Tab.1 Expression levels of lncRNA CASC9 and miR?758?3p in serum of two groups

2.3 HCC 患者血清中lncRNA CASC9、miR?758?3p 表達水平與患者臨床病理參數之間的關系lncRNA CASC9、miR?758?3p 在HCC 血清中的表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤大小和血清AFP 均無關（P＞0.05），與患者的肝硬化、淋巴結轉移和TNM 分期有關（P＜0.05）。見表2。

表2 lncRNA CASC9 和miR?758?3p 在HCC 血清中的表達水平與臨床病理參數之間的關系Tab.2 Relationship between the expression levels of lncRNA CASC9 and miR?758?3p in serum of HCC and clinicopathological parameters ±s

表2 lncRNA CASC9 和miR?758?3p 在HCC 血清中的表達水平與臨床病理參數之間的關系Tab.2 Relationship between the expression levels of lncRNA CASC9 and miR?758?3p in serum of HCC and clinicopathological parameters ±s

臨床病理參數年齡≤56 歲＞56 歲性別男 女腫瘤大小＞5 cm≤5 cm肝硬化有 無淋巴結轉移無 有TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期Ⅲ+Ⅳ期AFP＞200 ng/mL≤200 ng/mL例數32 40 49 23 26 46 46 26 52 20 47 25 41 31 lncRNACASC9 1.80±0.50 1.87±0.48 1.88±0.48 1.75±0.47 1.99±0.56 1.76±0.53 1.92±0.51 1.70±0.27 1.71±0.52 2.19±0.40 1.73±0.55 2.05±0.46 1.76±0.47 1.94±0.52 t 值0.604 0.609 1.733 2.392 3.720 2.482 1.537 P 值0.548 0.544 0.087 0.019＜0.001 0.015 0.129 miR?758?3p 0.79±0.31 0.75±0.28 0.74±0.29 0.83±0.30 0.70±0.29 0.81±0.37 0.71±0.31 0.88±0.27 0.83±0.29 0.61±0.33 0.86±0.30 0.60±0.22 0.80±0.29 0.74±0.26 t 值0.440 1.284 1.305 2.338 2.774 3.817 0.908 P 值0.661 0.203 0.196 0.022 0.007＜0.001 0.367

2.4 血清中lncRNA CASC9、miR?758?3p 和AFP的表達水平對HCC 診斷的價值進一步探討血清中lncRNA CASC9、miR?758?3p 和AFP 等3 指標對HCC 的診斷價值。

2.4.1 各指標的單獨應用以HCC 患者組為陽性樣本，以健康對照組為陰性樣本，建立ROC 診斷分析模型。經ROC 分析知：各指標對HCC 均有一定的診斷價值，ROC?AUC 分別為0.745（95%CI：0.632～0.879）、0.762（95%CI：0.641～0.907）、0.797（95%CI：0.707～0.899），見表3，ROC 分析曲線見圖2。

2.4.2 三指標的聯合應用采用SPSS 軟件的聯合應用ROC 理論模式：LogP 模式。結果顯示：聯合應用對HCC 的診斷價值比各單一指標均有明顯提高，ROC?AUC 為0.848（95%CI：0.767～0.937），見表3、圖2。

表3 血清中lncRNA CASC9、miR?758?3p 和AFP 指標對HCC 診斷價值之ROC 分析結果Tab.3 ROC analysis results of serum lncRNA CASC9，miR?758?3p and AFP in the diagnosis of HCC

圖2 ROC 分析曲線Fig.2 ROC analysis curve

3 討論

肝癌是全球常見腫瘤相關死亡原因，每年約有85 萬例新發病例［10］。HCC 是人類肝臟中的最常見腫瘤，約占所有原發性肝癌病例的90%，中國由于乙型肝炎病毒的流行，HCC 更為常見［11］。在HCC 的臨床治療中已采用了包括藥物干預、化學栓塞和外科治療在內的許多治療策略，但由于HCC 的異質性、復雜性和高復發，患者的病死率依然較高［3］。HCC 發生進展的潛在分子機制目前仍未完全闡明，lncRNA 是長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA，在包括表觀遺傳修飾、轉錄調控和轉錄后修飾等多種機制中具有調控功能［6］，近年來發現了大量與HCC 相關的lncRNA，并有部分可作為腫瘤早期診斷和預后的分子標志物［12］。

本研究首先采用qRT?PCR 檢測血清中lncRNA CASC9 的表達水平，結果顯示lncRNA CASC9 在HCC 患者血清中表達增加，且與患者的年齡、性別、腫瘤大小和血清AFP 無關，與患者的肝硬化、淋巴結轉移和TNM 分期相關。而ZENG 等［5］報道HCC 患者血清中lncRNA CASC9 的高表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM 分期、分化程度和AFP 相關，高表達lncRNA CASC9 的HCC 患者預后較差。本研究結果與ZENG 等［5］的研究均顯示lncRNA CASC9 參與HCC 的惡性進展，但是病理參數的相關性并不完全一致，分析原因可能與收集樣本例數的多少以及來源不同有關。lncRNA CASC9 是位于8q21.1 號染色體上的基因，研究報道lncRNA CASC9 在多種類型的人類腫瘤中發揮促癌作用，包括結直腸癌［13］、甲狀腺乳頭狀癌［14］和乳腺癌［15］等，在這些腫瘤中lncRNA CASC9 高表達與腫瘤患者的不良病理參數相關，在細胞體外實驗中ln?cRNA CASC9 促進腫瘤細胞的增殖和轉移能力，這些研究均提示lncRNA CASC9 是一種促癌因子。lncRNA 調控miRNA 的表達是參與腫瘤惡性生物學行為的重要作用分子機制［16］。研究報道在卵巢癌中lncRNA CASC9 作為miR?758?3p 的ceRNA 發揮促癌作用［7］。本文采用StarBase v2.0 軟件提示lncRNA CASC9 與miR?758?3p 存在潛在的結合位點，提示兩者在HCC 中可能存在調控關系。本研究通過qRT?PCR 檢測顯示，miR?758?3p 在HCC 患者血清中的表達顯著低于在對照組血清中的表達，且與患者的肝硬化、淋巴結轉移和TNM 分期相關，表明miR?758?3p 可能具有抑制HCC 進展的作用。細胞實驗發現［8］，miR?758?3p 可通過抑制小鼠雙微體2、雷帕霉素靶蛋白的表達抑制HCC 的增殖、轉移和侵襲。還有相關研究顯示，miR?758?3p 可抑制膀胱癌［17］、甲狀腺乳頭狀癌［18］、胃癌［19］等腫瘤的惡性進展，提示miR?758?3p 是一種抑癌因子。

由于外周血游離核酸檢測具有局部微創、操作簡單和成本低等優點，廣泛應用于各種疾病的診斷和預后［20］。目前AFP 是診斷HCC 早期的公認腫瘤標志物［4］，但其診斷價值還有待進一步提升。本研究通過ROC 分析顯示，lncRNA CASC9、miR?758?3p 與AFP 對HCC 均有一定的診斷價值，ROC?AUC 分別為0.745（95%CI：0.632～0.879）、0.762（95%CI：0.641～0.907）、0.797（95%CI：0.707～0.899），然而指標單獨檢測通常存在一定的缺陷，目前聯合檢測已成為趨勢。本研究發現，lncRNA CASC9、miR?758?3p 與AFP 聯合檢測HCC 診斷的敏感度和特異性均高于各指標的單獨檢測，ROC?AUC 為0.848（95%CI：0.767～0.937），提示lncRNA CASC9 和miR?758?3p 的聯合檢測在HCC 的診斷中具有重要指導意義。

綜上所述，血清lncRNA CASC9 和miR?758?3p在HCC 中均異常表達，二者的表達水平與肝硬化、淋巴結轉移和TNM 分期有關，二者可能參與了HCC 的惡性進展，兩者聯合AFP 對HCC 有較高的診斷價值。然而本研究選取的病例數較少，且僅設計了健康對照組，未納入單純肝硬化、病毒性肝炎、脂肪肝等良性肝臟疾病人群，這些不足之處將在后續的研究中加以完善。