健康女性與子宮內膜異位癥患者腸道菌群微生物組學研究

韋雅婧 梁炎春 楊如玉 雷舜天 王澤海 牛剛

1中山大學附屬第一醫院婦產科（廣州510080）；2中山大學中山醫學院（廣州510089）

子宮內膜異位癥（簡稱“內異癥”）是一種慢性炎癥性疾病，免疫失衡是異位病灶微環境最重要的特征之一［1-3］，可導致患者疼痛和不孕的發生和加劇［4］。發生深部浸潤型子宮內膜異位癥（deep infiltrating endometriosis，DIE）時，則會引起腹瀉或腸道運動障礙等癥狀［5］。腸道菌群失調與多種炎癥疾病的發生發展相關［6］。已有研究［7-10］證實內異癥患者或動物模型的宮頸、陰道和腸道存在菌群失調，但較少研究探究卵巢內異癥和DIE 患者的腸道菌群是否存在區別。本研究擬通過對健康女性、卵巢內異癥患者及DIE 患者的糞便進行測序、結果分析及功能預測，為下一步探究菌群失調在內異癥發展的作用提供證據和研究方向。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本收集經中山大學附屬第一醫院臨床研究倫理委員會批準，期間所有樣本均按倫理標準處理。經影像學檢查和（或）組織學診斷后，將患有卵巢內異癥的患者納入OE 組（n=14），DIE的患者納入DIE 組（n= 12），健康女性納入Control組（n=10）。內異癥患者糞便樣本于術前收集，健康女性的糞便在月經結束后7 d內收集。納入標準：（1）18 ～45歲未絕經女性；（2）BMI：18.5 ～24 kg/m2；（3）無腸道疾病家族史；（4）近3 個月無抗生素使用史。排除標準：（1）妊娠期婦女；（2）急性或慢性胃腸道疾病或盆腔炎。

1.2 研究方法提取糞便DNA 后對V3?V4 區進行PCR 擴增，純化擴增片段并構建PE2*300 文庫。對原始測序數據進行拼接、聚類及物種分類學注釋。

1.3 統計學方法使用R 語言進行α多樣性分析（Student′t檢驗）、主坐標分析（PCoA）、群落組成分析、物種差異分析（Kruskal?Wallis 秩和檢驗，FDR校正）。使用PICRUSt 軟件進行功能預測分析。P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料OE 組、DIE 組和Control 組的年齡和BMI 差異無統計學意義（P＞0.05），提示以上研究組的資料具有可比性。

2.2 物種組成分析Firmicutes、Bacteroidete、Pro?teobacteria 和Actinobacteria 是各組主要組成物種。OE 組以及DIE 組相對豐度＜1%的菌群（歸為oth?ers）比例增多（圖1），其中Desulfobacterota、Verru?comicrobiata在兩組中均增多。Synergistota在DIE組更高。Fusobacteriota 在OE 組更高（圖2）。

圖1 各組物種組成（門水平）Fig.1 Microbiome composition among three groups（Phylum）

2.3 多樣性比較常用Shannon、Simpson、Chao 和Ace 指數來表示α多樣性。4 個指數在OE 組和DIE組均高于Control 組，但差異無統計學意義（圖3）。

PCoA 結果可用來反映β多樣性。各組樣本點的距離相近，表示組間的β多樣性差異無統計學意義（P＞0.05，圖4）。

圖2 群落Heatmap 圖（門水平）Fig.2 Heatmap of community in phylum level

圖3 組間微生物群落α多樣性的比較Fig.3 Comparison of α diversity among three groups

2.4 組間物種差異分析門水平，Firmicutes在DIE組較多；Bacteroidete在Control組最多；Proteobacteria和Actinobacteria 在OE 組最多，均差異無統計學意義。綱水平，Negativicutes 在OE 組最低。屬水平，OE 組 和DIE 組 的Fusicatenibacter顯 著 減 少，NK4A214_group顯著增多。種水平，OE 組和DIE 組的Fusicatenibacter顯著減少；Eubacterium_coprosta?noligenes_group顯著增高，差異均具有統計學意義（P＜0.05，圖5）。

2.5 功能預測分析代謝通路預測結果發現，新陳代謝功能的相對豐度最高（圖6）。糖代謝和氨基酸代謝的相對豐度在OE 組最高（表1）。氨基酸的嘌呤代謝相對豐度最高，嘧啶代謝次之（表2）。在代謝通路水平3，ABC轉運蛋白在OE組豐度最高（表2），與COG 樣本豐度統計的結果一致（圖7）。

圖4 組間PCoA 矩陣分析Fig.4 PCoA analysis among three groups

3 討論

對卵巢內異癥患者、DIE 患者和健康女性的糞便測序后發現，OE 組和DIE 組的Negativicutes 和Fusicatenibacter顯著降低，NK4A214_group和Eubac?terium_coprostanoligenes_group顯著增高。氨基酸代謝和ABC 轉運蛋白功能可能在卵巢內異癥的發展中發揮著作用。

3.1 子宮內膜異位癥與免疫失衡免疫失衡導致異位病灶局部微環境的改變是內異癥疼痛和不孕的重要原因，也是其發展的關鍵因素［11-13］。免疫失衡可通過信號通路影響病灶新生血管和神經的生成，促進異位病灶的發展［14-15］。抑制相關通路可減少病灶炎癥細胞的浸潤程度，減輕動物模型的慢性機械疼痛［16］。

圖5 菌群組間差異分析Fig.5 Differences of microbiome among three groups

圖6 通路水平1 各功能相對豐度分析Fig.6 Relative abundance of various functions in Pathway level 1

表1 代謝通路水平2Tab.1 Pathway level 2 of metabolism

3.2 腸道菌群與子宮內膜異位癥腸道菌群可提供屏障功能、預防病原體感染及調節免疫等作用，與人類健康狀態或疾病的發生發展密切相關［17-18］。已有研究表明內異癥患者及動物模型存在菌群失調。Ⅲ/Ⅳ期內異癥患者宮頸的加德納菌屬、腸道埃希菌屬和志賀菌屬增多［10］。患有內異癥的恒河猴腸道乳酸桿菌數量減少，革蘭陰性菌顯著增加［9］。內異癥小鼠腸道菌群放線菌門、厚壁桿菌門的豐度增加；“厚壁桿菌/擬桿菌”的比值（被認為是菌群失調的特征）約為對照組的2 倍［7］。用擬桿菌敏感的甲硝唑處理后的異位病灶，其體積和重量下降，巨噬細胞浸潤減少［8］。然而，這些證據僅分析了內異癥與健康對照組菌群的差異，暫無不同類型內異癥的腸道菌群的比較。卵巢內異癥是內異癥最常見的一種類型，可不伴有癥狀［19］。DIE 是內異癥中最復雜和嚴重的一種病理類型，常伴嚴重痛經和（或）周期性腸道癥狀［20］。本研究發現，OE 組及DIE 組中豐度顯著增高的菌群多為革蘭陰性菌。革蘭氏陰性菌外膜的脂多糖通常能抵抗并清除病原菌。然而，脂多糖也可引起組織損傷，刺激炎癥反應，導致發熱、多器官衰竭和死亡［21-23］。OE 組和DIE 組革蘭陰性菌的異常增高可能通過脂多糖影響異位病灶的免疫微環境，進而疾病的發展及相關癥狀的發生。

表2 代謝通路水平3Tab.2 Pathway level 3 of metabolism

圖7 COG 樣品豐度統計圖Fig.7 Relative abundance of COG samples

綜上所述，卵巢內異癥患者、深部浸潤型內異癥患者和健康女性的腸道菌群存在不同程度的差異，這可能與內異癥的發展及癥狀的發生密切相關。腸道菌群失調如何介導的免疫失衡參與內異癥的發展，是后續的重點研究方向。