電活性生物膜通過調控巨噬細胞極化促進骨再生修復的體外研究

朱培君 賴春花 程鳴威 何逸恒 徐淑蘭

南方醫科大學口腔醫院種植中心（廣州510300）

口腔種植是牙頜系統重建的首選修復方案［1］。種植術區充足的骨量是實現骨整合的必要條件［2］，而炎癥、外傷等原因造成的牙列缺損常伴骨組織缺損。臨床上常應用引導骨組織再生術（guided bone regeneration，GBR）修復骨缺損，該術式創傷小且操作方便，規避了植骨手術高并發癥的風險［3］。然而，臨床常用的GBR 屏障膜缺乏成骨誘導性能，對于嚴重骨缺損的修復效果不佳，具備成骨誘導性能的屏障膜是解決GBR 術弊端的核心［4］。關于材料成骨誘導性能的研發，目前的研究熱點集中于生物材料調控骨缺損區的免疫環境向有利于骨再生的方向發展，招募更多的骨原細胞，并促進骨礦化及重建［5］。此理念源自于骨免疫學說，生物材料植入機體后，將不可避免地引發免疫反應，巨噬細胞作為首先接觸生物材料的免疫細胞之一，在生物材料植入后將轉換為M1 促炎分型以行使“清道夫”的功能，而M2 抗炎型巨噬細胞分泌的抗炎因子和成骨因子在后期的骨愈合過程中發揮至關重要的作用［6-8］。巨噬細胞M1/M2 表型的轉換決定了骨缺損修復生物材料周圍的炎癥程度及其骨修復效果，所以利用具備免疫調節性能的生物材料調節巨噬細胞M2 極化，營造有利于成骨分化的免疫環境，進而促進骨組織再生的研究思路是生物材料研發的創新導向，學者們將此性能稱之為生物材料的骨免疫調節性能［9-10］。

研究表明，表面電荷可以調控巨噬細胞M2 極化［11］、減低巨噬細炎癥反應而應用于腎臟再灌注損傷的治療［12］，基于表面電荷對巨噬細胞的調控作用，本課題以研發一種能夠調控巨噬細胞M2 極化的屏障膜為目的，已知P（VDF?TrFE）膜是一種適用于組織再生的電活性材料，利用其高壓極化后表面帶電的鐵電性能［13］，本研究制備帶電的P（VDF?TrFE）膜，以不帶電的P（VDF?TrFE）膜為對照組，明確帶電P（VDF?TrFE）膜對巨噬細胞M2 極化的影響，并構建多細胞共培養體系，進一步探究帶電P（VDF?TrFE）膜介導的巨噬細胞環境下，BM?SCs 的成骨活性改變。為骨免疫調節性的新型生物材料的臨床應用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 帶電P（VDF?TrFE）膜的制備及材料學表征P（VDF?TrFE）聚合物粉末溶于N，N?二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，攪拌至粉末完全溶解。溶液在鈦片成膜后放置于馬弗爐中，升溫后退火結晶，冷卻至室溫，即獲得P（VDF?TrFE）薄膜。將P（VDF?TrFE）膜放置于銅槽中，浸在二甲基硅油中，采用油浴極化的方法，在6 kV/cm、120 ℃條件下極化1 h，清洗、干燥備用。實驗分組：P（VDF?TrFE）膜經高壓極化后可形成帶電表面，分為帶電P（VDF?TrFE）膜（charged P（VDF?TrFE）membrane，CF）和不帶電P（VDF?TrFE）膜（uncharged P（VDF?TrFE）membrane，UF）兩組。

采用掃描電子顯微鏡觀察并分析P（VDF?TrFE）膜的表面形貌和微觀尺寸；采用準靜態D33 測量儀檢測P（VDF?TrFE）膜的壓電常數D33。采用Zeta電位檢測儀測量P（VDF?TrFE）膜的表面電勢。

1.2 P（VDF?TrFE）膜上的巨噬細胞的M2表型檢測

1.2.1 細胞培養與分組將小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7（來源：ATCC 細胞庫）培養于10%胎牛血清（FBS）和1%青/鏈霉素的高糖DMEM培養基，并置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養。細胞融合至80%，胰蛋白酶消化，在P（VDF?TrFE）膜上以5×104個細胞/cm2的密度進行細胞接種，分組同材料分組。

1.2.2 細胞增殖無菌消毒處理后的P（VDF?TrFE）膜置于12孔板中，將巨噬細胞接種至P（VDF?TrFE）膜表面，3、5 d 后終止培養，將P（VDF?TrFE）膜用無菌鑷子取出放置于新的12 孔板中，PBS 漂洗，加入含10%細胞數量檢測試劑盒?8（cell counting kit?8，CCK?8）試劑，孵育2 h，取上清液于96 孔板中，采用酶標儀測量450 nm 波長下的吸光度。

1.2.3 細胞形態檢測將巨噬細胞接種至P（VDF?TrFE）膜表面，在培養3、5 d后，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，洗滌，透化。加入染料4，6?聯脒?2?苯基吲哚及熒光素異硫氰酸酯，對細胞核及骨架進行染色。避光孵育40 min 后，將膜轉至載玻片上，封片，觀察并采集圖像。

1.2.4 流式細胞術檢測巨噬細胞的M2 極化分型將細胞細胞接種至P（VDF?TrFE）膜表面，培養3、5 d 后，重懸洗滌，以每流式管1 × 106個細胞為標準，100 μL 含0.1%BSA 的PBS 重懸；向各管細胞中依次加入2 μL PE 標記的小鼠CD206（M2型巨噬細胞表面標記物）抗體，采用Cytoflex 流式細胞儀檢測陽性細胞。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT?PCR）檢測M2表型相關基因將細胞接種至P（VDF?TrFE）膜表面，培養3、5 d 后提取RNA 并逆轉錄，采用熒光定量PCR 儀進行cDNA 擴增，檢測M2 型巨噬細胞的相關基因精氨酸酶?1（arginase?1，Arg?1）、白介素?10（interleukin?10，IL?10）的mRNA 表達水平（引物序列見表1）。采用相對定量法分析結果。

表1 qRT?PCR 引物Tab.1 Primers for qRT?PCR

1.3 條件培養基誘導對rBMSCs的成骨活性的影響

1.3.1 條件培養基的配制為了構建P（VDF?TrFE）膜、巨噬細胞、BMSCs的間接共培養體系，將巨噬細胞按上述方式接種于P（VDF?TrFE）膜上，收集培養體系的上清液，1 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄沉淀，上清液與DMEM/F12 完全培養基以1∶1 的比例混合配制，即獲得P（VDF?TrFE）膜?巨噬細胞條件培養基（conditioned medium，CM），-80 ℃保存待用。

1.3.2 rBMSCs 的培養將rBMSCs（來源：ATCC細胞庫）培養于含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的DMEM/F12 完全培養基中，37 ℃、5% CO2培養箱中孵育。取3 ～6 代的rBMSCs 以1 × 105的細胞密度接種于六孔板中，待細胞穩定后，將完全培養基替換為P（VDF?TrFE）膜?巨噬細胞條件培養基，根據材料分組，分為帶電P（VDF?TrFE）膜（CF）和不帶電P（VDF?TrFE）膜（UF）兩組。

1.3.3 ALP 染色條件培養基刺激誘導rBMSCs的第7 天，終止培養，PBS 洗滌，4%多聚甲醛固定后洗滌，加入染色劑，搖床上孵育1 h，雙蒸水終止染色后，顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 茜素紅定性染色及定量檢測條件培養基誘導刺激rBMSCs 的第14 天，終止培養，雙蒸水洗滌后固定細胞，加入茜素紅染色劑，搖床上孵育30 min，洗滌，顯微鏡觀察并拍照，最后于六孔板中加入1 mL 的10%十六烷基吡啶溶液/孔，酶標儀檢測562 nm 波長下的吸光度。

1.4 統計學方法實驗所得數據使用SPSS 20.0記錄并分析，正態分布資料用均數±標準差表示，采用兩獨立樣本t檢驗進行數據分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P（VDF?TrFE）膜的材料學檢測表面形貌結果（圖1A）顯示本實驗所制備的P（VDF?TrFE）膜表面均勻且致密，存在少量微孔隙，兩組表面形貌無明顯差異；為了表征材料的電學性能，檢測P（VDF?TrFE）膜的壓電常數D33，帶電、不帶電P（VDF?TrFE）膜壓電常數D33 分別為（-10 ±0.06）pC/N、（0±0.02）pC/N；Zeta 電位檢測表征材料表面電荷，結果見圖1B。

圖1 不帶電、帶電P（VDF?TrFE）膜的材料表征Fig.1 Characterization of uncharged and charged P（VDF?TrFE）membrane

2.2 P（VDF?TrFE）膜上巨噬細胞的行為改變

2.2.1 細胞增殖P（VDF?TrFE）膜上巨噬細胞的CCK?8 檢測結果見圖2A，培養第3 天，帶電、不帶電P（VDF?TrFE）膜的細胞數量差異無統計學意義，而到培養的第5 天，帶電P（VDF?TrFE）膜組的巨噬細胞增殖情況優于不帶電組（P＜0.05）。

2.2.2 細胞形態圖2B 為巨噬細胞在帶電、不帶電P（VDF?TrFE）膜上的形態圖，巨噬細胞在刺激培養的第3 天，在P（VDF?TrFE）膜上表現為圓形的正常形態，帶電膜表面的巨噬細胞偶見伸長的形態；在細胞培養的第5 天，不帶電膜表面的細胞仍保持圓形形態，而帶電P（VDF?TrFE）膜上的細胞胞體向兩級伸長。

2.2.3 巨噬細胞的M2 極化分型巨噬細胞在不帶電、帶電P（VDF?TrFE）膜上的M2 表型檢測結果如圖3A，圖中陰性對照組（negative control）是未加入抗體的細胞空白對照組，培養第3 天，CD206 陽性細胞率分別為2.28%和2.31%。培養第5 天，相比于不帶電P（VDF?TrFE）膜（2.4%），帶電P（VDF?TrFE）膜上的M2 型巨噬細胞（32.7%）占多數。

2.2.4 巨噬細胞M2表型相關基因的表達水平巨噬細胞在P（VDF?TrFE）膜上的基因表達檢測結果（圖3B）顯示，P（VDF?TrFE）膜刺激巨噬細胞第3 天后，兩組基因表達水平的差異無統計學意義（P＞0.05）。在培養的第5 天，相比于不帶電膜，帶電P（VDF?TrFE）膜上的巨噬細胞較高地表達Arg?1、IL?10 等M2 表型相關基因（P＜0.05）。

2.3 條件培養基誘導對rBMSCs 成骨活性的影響

圖2 巨噬細胞在不帶電、帶電P（VDF?TrFE）膜上的行為改變Fig.2 Behavioral changes of macrophage on uncharged and charged P（VDF?TrFE）membrane

2.3.1 ALP染色分別用帶電、不帶電P（VDF?TrFE）膜?巨噬細胞條件培養基誘導rBMSCs，7 d 后ALP染色的結果如圖4A，相比于不帶電組組，帶電P（VDF?TrFE）膜條件培養基誘導下的rBMSCs 周圍可見更多的藍染物質，顏色較對照組深。

2.3.2 茜素紅染色及定量分析結果結果如圖4B，相比于不帶電組，帶電組條件培養基誘導的rBMSCs 周圍可見大量紅褐色結節，結節體積較大且分布廣泛，茜素紅染色的半定量檢測結果與染色結果一致（P＜0.05）。

3 討論

口腔頜面部的大面積骨缺損嚴重影響患者的語音、吞咽及咀嚼功能，成為口腔頜面臨床修復亟待解決的難題［14］。引導骨組織再生術作為臨床上最有效的骨增量方式之一，即是采用具備物理屏障作用的屏障膜覆蓋于骨缺損區上，阻擋軟組織細胞長入缺損區產生競爭性抑制，為骨缺損區的修復再生創造穩定而無干擾的空間［15］。由于大面積骨缺損缺乏自愈的潛力，臨床上對修復此類骨缺損的屏障膜提出更高的要求，即在發揮物理屏障作用的同時，兼具促進骨再生的生物活性。為了研發新型骨缺損修復材料，并鑒于免疫細胞對骨再生的重要調控作用，學者們提出了生物材料通過改變免疫環境間接促進成骨的性能即骨免疫調節性能［16-17］，并闡明了機體的成骨活動是由多細胞、多系統共同參與的［18］，利用單細胞體外模型來驗證生物材料的成骨效能的研究思路過于單一，生物材料通過介導免疫細胞行為變化調控成骨分化的思路才更符合體內成骨過程。

圖3 不帶電、帶電P（VDF?TrFE）膜上巨噬細胞M2 極化表型檢測Fig.3 The deteetion of M2 phenotype macrophage on uncharged and charged P（VDF?TrFE）membrane

圖4 rBMSCs 成骨活性檢測Fig.4 Detection of osteogenic activity of rBMSCs

巨噬細胞是生物材料植入機體內首先接觸的免疫細胞［19］。大量體內外實驗驗證了巨噬細胞對骨再生的體內外調控作用［20-21］，生物材料誘導巨噬細胞M2 極化的功能在骨缺損修復過程中發揮著關鍵作用，M2 型巨噬細胞通過分泌抗炎因子IL?10、Arg?1 和成骨因子增強成骨活性［22］。誘導巨噬細胞M2 極化的生物材料設計理念被廣泛應用于屏障膜、種植體表面處理等研究中［23-24］。其中巨噬細胞具備高度可塑性，表面電荷對巨噬細胞M2 極化發揮一定的調控作用［25］，本課題將表面電荷對巨噬細胞的調控作用引入屏障膜的設計研發中，制備攜帶表面電荷的P（VDF?TrFE）生物膜并檢測其對巨噬細胞極化及后繼成骨分化的影響。

本實驗制備的膜材料具有均勻且致密的形貌，這符合臨床屏障作用的要求，并且膜上的微觀孔隙也是屏障膜傳輸營養的通道，CCK?8 檢測結果也提示了帶電P（VDF?TrFE）膜的良好生物相容性，可知帶電P（VDF?TrFE）膜符合臨床屏障膜的基本要求。壓電常數D33 和Zeta 電位檢測結果提示著帶電P（VDF?TrFE）膜的成功制備。巨噬細胞在帶電P（VDF?TrFE）膜刺激下，細胞胞體向兩級伸長，此形態與其M2 極化相關［26］。流式、PCR 結果表明了帶電P（VDF?TrFE）膜能有效促進巨噬細胞的M2 極化，增加抗炎IL?10 基因的表達。利用上清液制取條件培養基的間接共培養模型被廣泛應用于生物材料骨免疫調節性能的研究中［16］，本實驗條件培養基誘導刺激rBMSCs 的實驗結果中，ALP 和茜素紅染色分別提示著帶電膜?巨噬細胞條件培養基能有效增加rBMSCs 的早期和晚期成骨活性，闡明了帶電P（VDF?TrFE）膜通過調控巨噬細胞極化促進BMSCs 成骨分化的作用。

本實驗以研發促進成骨分化的屏障膜為目的，考慮到生物材料植入后的多細胞參與體系及免疫細胞在成骨活動中的重要作用，以研究電活性生物膜的骨免疫調節性能為導向，構建膜、巨噬細胞、BMSCs 的共培養體系，成功驗證了帶電P（VDF?TrFE）膜對巨噬細胞M2極化的促進作用，提示了帶電P（VDF?TrFE）膜介導的M2 極化對BMSC成骨分化的積極影響，這對于兼具免疫調節性能及促成骨性能生物材料的研發具有指導性意義，為屏障膜的優化設計提供創新性思路。