視黃醇結合蛋白2基因沉默對卵巢癌SKOV3/PTX細胞遷移侵襲的影響

馮同富 陳德軍 葉常鴻 汪黎明 金晶 雷燕 李力

1湖北省婦幼保健院婦科（武漢430070）；2廣西醫科大學區域性高發腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室（南寧530021）

卵巢癌由于發病隱蔽、易轉移，成為致死率最高的婦科惡性腫瘤［1］。癌細胞的轉移是一種涉及到多種分子機制的復雜生理病理過程。研究表明，視黃醇結合蛋白2（retinol?binding protein 2，RBP2）參與了多種惡性腫瘤的發生和進展過程［2-3］，但其和卵巢癌的侵襲轉移是否存在關聯，目前國內外還鮮有報道。因此，本研究選擇更易發生轉移的卵巢上皮癌耐藥細胞SKOV3/PTX，通過小分子干擾RNA 技術抑制RBP2 的表達，探討RBP2 基因沉默對卵巢癌上皮細胞遷移和侵襲能力的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及質粒卵巢癌SKOV3 細胞系及其紫杉醇（paclitaxel，PTX）耐藥細胞系SKOV3/PTX 細胞由廣西醫科大學惠贈。

1.1.2 試劑及儀器RT?qPCR 試劑盒購自美國In?vitrogen 公司；蛋白印跡法（Western blot）檢測試劑套裝購自上海Beyotime 公司；Matrigel 生物膠購自美國BD 公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；GAPDH、β?actin 及RBP2 抗體購自英國Abcam公司；β?catenin、VEGF、及MMP?2 抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司，離心機購自德國Eppendorf 公司，熒光倒置顯微鏡購自日本Olympas 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染所有細胞均用含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。參照干擾效果最好的針對RBP2 基因的shRNA 和陰性對照shRNA?NC，建立重組慢病毒干擾載體，并轉染SKOV3/PTX細胞，48 h后利用熒光顯微鏡觀察轉染效率，再使用嘌呤霉素篩選，獲得穩定傳染細胞株。實驗分為三組，干擾組：感染沉默RBP2的慢病毒的SKOV3/PTX細胞（SKOV3/PTX?RBP2i）；陰性對照組：感染陰性對照慢病毒的SKOV3/PTX細胞（SKOV3/PTX?NC）；空白對照組：未感染的SKOV3/PTX 細胞（SKOV3/PTX）。

1.2.2 劃痕實驗檢測細胞遷移能力取生長良好的、呈對數生長的三種細胞，調整細胞密度為6 ×105cell/mL 并接種于六孔板，每孔1 mL，常規培養過夜，待細胞密度達到90%左右，用槍頭進行劃痕，用PBS 洗細胞3 次，然后放入培養箱中常規培養，于0、24、48 h 拍照分析。

1.2.3 Transwell 侵襲實驗檢測細胞侵襲能力每組取3 × 105個細胞接種于transwell 小室表面，37 ℃，5% CO2培養箱培養24 h 后用70%冰乙醇溶液固定細胞1 h；用0.5%結晶紫染液染色20 min，PBS 清洗后顯微鏡下觀察拍照。計算侵襲細胞數。實驗重復3 次。

1.2.4 RT?PCR 法檢測細胞中的基因表達取對數生長期細胞進行胰酶消化，離心后收集細胞，Trizol 法提取總RNA 并逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，引物序列：β?catenin 上游：5′?CAAGTGG?GTGGTATAGAGG?3′，下游：5′?AGTCCATAGTGAA?GGCGAAC?3′；VEGF 上游：5′?ATCCAATCGAGACC?CTGGTG?3′，下游：5′?ATCTCTCCTATGTGCTGGCC?3′；MMP?2 上游：5′?ACCACAGCCAACTACGATGA?3′，下游：5′?GCTCCTGAATGCCCTTGATG?3′；內參GAPDH 上游5′?TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT?3′，下游5′?TTACTTCGTCCAACCACCGA?3′。擴增條件：50 ℃2 min，95 ℃10min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，40 個循環，以GAPDH 為內參計算RBP2 的相對表達量，繪制溶解曲線，最終數據以2?△△Ct進行分析，實驗重復3 次。

1.2.5 Western blot法檢測細胞中的蛋白表達提取各組總蛋白并檢測蛋白濃度。根據各組蛋白濃度上樣，以90 V 電壓進行SDS?PAGE 電泳，分離后轉膜、封閉，1 h 后加入相應的一抗4 ℃孵育過夜。第2 天，將膜取出并以TBS 清洗3 次，加入二抗室溫孵育2 h；然后，TBS 緩沖液洗滌3 次，最后放入TBST 中漂洗10 min。在凝膠成像系統利用超敏ECL 化學發光底物曝光顯影，存儲圖片。以GAP?DH 作為內參照分析目的蛋白的相對表達量。實驗重復3 次。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，計量資料以表示，計量資料兩組間比較采用t檢驗，兩組以上的組間比較采用單因素方差分析法，組內兩兩多重比較采用SNK?q檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RBP2基因表達沉默的SKOV3/PTX細胞系的鑒定建立穩定干擾RBP2 表達的細胞株SKOV3/PTX?RBP2i 后采用Western blot 法進行鑒定，結果顯示，轉染重組載體后，SKOV3/PTX?RBP2i 細胞中RBP2 的蛋白表達水平明顯低于SKOV3/PTX?NC 細胞及SKOV3/PTX 細胞，見圖1。說明RBP2 基因表達沉默的SKOV3/PTX 細胞系構建成功。

圖1 RBP2 基因表達沉默細胞系SKOV3/PTX?RBP2i 蛋白水平的鑒定Fig.1 The silence effect on protein level in SKOV3/PTX?RBP2i

2.2 劃痕實驗結果分析劃痕實驗結果分析提示，SKOV3/PTX?RBP2i 細胞、SKOV3/PTX?NC 細胞及SKOV3/PTX 細胞在24、48 h 的劃痕愈合率分別為（37.74±3.61）%、（55.87±4.21）%；（75.24±3.16）%、（95.66±4.06）%；（72.38±2.83）%、（98.24±3.15）%，差異有統計學意義（F= 218.063，P＜0.01；F=198.173，P＜0.01），且沉默組均于陰性對照組及空白對照組（24 h：q= 25.031，P＜0.01；q= 26.090，P＜0.01，48 h：q= 23.382，P＜0.01；q= 25.274，P＜0.01），差異有統計學意義，但SKOV3/PTX?NC 細胞與SKOV3/PTX細胞之間，劃痕的愈合率差異有統計學意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 侵襲實驗結果分析體外侵襲實驗顯示，沉默組、陰性對照組和空白對照組的穿膜細胞數量分別為（24.13±3.39），（63.32±3.81），（66.43±3.58），差異有統計學意義（F=128.842，P＜0.01）。其中，陰性對照組和空白對照組的穿膜細胞數明顯高于沉默組，差異有統計學意義（q= 18.869，P＜0.01；q=20.366，P＜0.01），見圖3。

圖2 各組細胞的劃痕愈合情況Fig.2 Healing ability of each groups

圖3 各組細胞的侵襲情況Fig.3 Invasionability of each groups

2.4 β?catenin、VEGF 及MMP?2 在三組細胞中的表達情況RT?PCR 檢測提示，沉默組、陰性對照組和空白對照組的β?catenin、VEGF 及MMP?2 的mRNA 表達水平差異有統計學意義（F= 10.443，P＜0.05；F=11.681，P＜0.01；F=30.645，P＜0.01），且上述三個指標在沉默組SKOV3/PTX?RBP2i 細胞中的表達水平均低于陰性對照組SKOV3/PTX?NC細胞和空白對照組SKOV3/PTX 細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）；Western blot 法檢測顯示，沉默組、陰性對照組和空白對照組的β?catenin、VEGF及MMP?2 的蛋白表達水平差異也有統計學意義（F= 22.144，P＜0.01；F= 45.068，P＜0.01；F=16.579，P＜0.01），同樣，三個指標在陰性對照組和空白對照組的表達水平均低于沉默組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組細胞中β?catenin、VEGF 及MMP?2 的表達Fig.4 Expression of β?catenin、VEGF and MMP?2 proteins in each groups

3 討論

惡性腫瘤是威脅人類健康的嚴重疾病。局部浸潤和遠處轉移是惡性腫瘤最主要的生物學特性，而且是導致患者死亡的主要原因［4］。卵巢癌作為常見的婦科惡性腫瘤之一，更易發生侵襲和轉移，因此，其5年生存率僅為35%［5］。克服卵巢癌的侵襲性和轉移性成為延長卵巢癌患者生存期的關鍵所在。RBP2 具有組蛋白去甲基化轉移酶的活性，它廣泛參與了腫瘤的發生［6］、分化［7］及轉移［8］等生物學行為。目前，RBP2 在卵巢癌侵襲轉移中的作用相對研究較少，探討其在卵巢癌細胞侵襲轉移過程中的作用和分子機理有著重要的研究意義。一般而言，卵巢癌耐藥細胞較親本細胞更容易發生侵襲和轉移。因此，本研究在卵巢癌耐藥細胞SKOV3/PTX 中敲低RBP2 的表達，發現RBP2 表達受到抑制后，卵巢癌細胞的遷移能力極大下降。侵襲實驗也表明干擾RBP2 的表達可以顯著降低SKOV3/PTX 細胞的侵襲轉移能力，本研究初步證實RBP2 參與了卵巢癌細胞的侵襲和轉移。

腫瘤的侵襲和轉移過程及調控機制非常復雜，目前，已發現FAK/ERK1/2/MMP9/NANOG/SOX9［9］、PI3K/Akt［10］、Wnt/β?catenin［11］、MAPK/JNK/p38［12］等多條信號通路與卵巢癌的侵襲轉移密切相關，其中Wnt/β?catenin 信號通路可能是較為重要的一條，它在卵巢癌的發生、耐藥及轉移中都發揮著關鍵作用［13-14］。為了明確RBP2 是否通過Wnt/β?catenin信號轉導通路參與了卵巢癌的侵襲轉移，本實驗研究了Wnt/β?catenin 信號通路中的3 個重要信號蛋白，即β?catenin、VEGF 與MMP?2 的表達水平和RBP2 間的關系。結果表明，當沉默RBP2 基因后卵巢癌細胞中β?catenin、VEGF 與MMP?2 的mRNA及蛋白水平表達均顯著降低，這充分說明，RBP2基因可能通過Wnt/β?catenin 通路調節β?catenin、VEGF 與MMP?2 的表達進而影響卵巢癌細胞的侵襲和轉移。借助這一信號途徑，RBP2 對癌細胞侵襲轉移的調節得到級聯放大的效果。因為β?catenin作為上游分子可以通過多個下游因子直接或間接的影響細胞的侵襲轉移。ZHU 等［15］研究發現，β?catenin 在卵巢癌細胞中可經由PRR11（proline?rich protein 11）影響MMP?2 的表達，進而影響卵巢癌細胞的遷移和侵襲。另有體外研究［16］表明，利用siRNA 靶向沉默β?catenin 基因阻斷Wnt/β?catenin信號通路能明顯抑制子宮內膜異位癥模型裸鼠異位內膜組織VEGF 和MMP?9的表達及血管生成。VEGF 可以通過刺激腫瘤相關的血管生成來促進腫瘤的生長和轉移，因此，VEGF 的表達水平一定程度上和腫瘤的惡性程度密切相關［17］。研究發現，VEGF?C 和VEGF?D 可促進腫瘤淋巴管的生長，促進腫瘤細胞向淋巴結的轉移擴散［18］，而且VEGF?C還與患者的生存率密切相關。卵巢癌患者腹膜后腫瘤的進展與VEGF?C 的高表達有關，VEGF?C 高表達患者的總體生存率明顯低于低表達患者［19］。MMP?2 也是與腫瘤侵襲和遷移密切相關的重要蛋白酶之一。LI 等［20］研究證實，MMP?2 的表達增加可以促進卵巢癌A2780 細胞的侵襲和遷移，而用有關抑制劑抑制其表達后，卵巢癌A2780 細胞的侵襲和遷移能力明顯下降。由于VEGF 和MMP?2和腫瘤的侵襲轉移關系密切，所以同時降低VEGF與MMP?2 的表達可以顯著抑制卵巢癌上皮細胞的遷移和侵襲［21］。另外，一項關于直腸癌的研究表明，患者血清中VEGF 和MMP?2 的表達與腫瘤的浸潤深度、Dukes 分期及淋巴結轉移密切相關，提示VEGF 和MMP?2 的水平可作為判斷腫瘤患者預后和預測是否轉移的有效指標［22］。

綜上所述，本研究從細胞層面初步證實RBP2參與了卵巢癌細胞的遷移和侵襲，其機制可能和Wnt/β?catenin 信號通路有關，但其如何啟動Wnt/β?catenin 通路的信號傳導及與其它促腫瘤轉移因子間的作用等還需后續研究尤其是動物實驗的探討和驗證。