血清活性氧簇、還原型谷胱甘肽水平與原發性膽汁性肝硬化的相關性分析

江小云，陳 科，馬思思，董家琪

(四川省德陽市人民醫院消化內科，四川 德陽 618000)

原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)為消化內科因肝內小膽管進行性非化膿性炎癥引發的膽汁淤積性疾病[1]。目前，臨床針對PBC的病因機制尚不明確，可能與遺傳、環境、自身免疫等有關，診斷以癥狀體征、免疫學檢查及組織病理學檢查等綜合判斷為主[2]。隨著分子生物學及細胞因子學的不斷發展，諸多學者指出PBC發病及進展中存在多種血清學指標變化，早期監測可為PBC臨床診斷及病情發展提供重要依據[3]。PBC是免疫介導的炎性疾病，其病理學特點以肝纖維化及肝細胞破壞等為主，不及時治療可發展為肝衰竭[4]。血清活性氧簇(ROS)是一類由吞噬細胞分泌釋放的細胞因子，在正常生理狀態下通過肝臟的酶系統發揮解毒作用，而當肝細胞破壞后，過量的ROS則反過來加劇炎癥反應，促使肝功能障礙[5]。還原型谷胱甘肽(GSH)作為抗氧化劑的一種，可中和“ROS”作用，起到緩解肝損傷，減輕氧化應激反應的效果[6]。目前，有關ROS、GSH水平與氧化應激的關系及相互作用已有報道[7]，但其在PBC中的變化及診斷效能尚無定論。本研究探討兩種血清標志物與PBC的相關性，為臨床判斷提供可靠數據支撐。

1 資料與方法

1.1 一般資料2017年1月至2019年6月我院接受治療的121例PBC患者(觀察組)，納入標準：①符合美國肝臟病學會(AASLD)2009年頒布的PBC相關診斷標準[8]，并通過肝穿刺病理學檢查確診者；②其家屬自愿簽署知情同意書者；③臨床各項檢查資料完整者；④年齡≥18歲者；⑤初次確診為PBC，并于我院接受熊去氧膽酸(UDCA)治療者。排除標準：①合并心、腦等器官病變者；②合并自身免疫性疾病者；③合并原發性肝癌、肝血管瘤、肝腺瘤、肝囊腫、肝硬化再生結節等肝內占位性病變者；④遵醫行為差，無法配合后續隨訪工作者；⑤治療前已存在干燥綜合征、甲狀腺炎、骨質疏松等并發癥者。選取同期接受體檢的自愿者60例為健康對照組。觀察組男9例，女112例，年齡35～76歲[(54.52±7.54)歲]，體重指數(BMI)20 ～24 kg/m2[(22.50±0.84)kg/m2]，健康對照組男4例，女56例，年齡34～70歲[(53.21±7.14)歲]，BMI 20 ～24 kg/m2[(22.67±0.91)kg/m2]。兩組性別、年齡、BMI比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已獲得醫院倫理會員會批準。

1.2 方法常規靜脈采血后提取血清，通過CA-800C全自動生化分析儀(桂林優利特醫療電子有限公司，桂械注準20172400011)測定兩組丙氨酸轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、白蛋白(ALB)水平；采用酶聯免疫法測定透明質酸(HA)，試劑盒來自深圳市安群生物工程有限公司；采用化學發光法測定層粘連蛋白(LN)，試劑盒來自深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司；采用酶聯免疫法測定Ⅲ型前膠原(PCⅢ)水平，試劑盒來自深圳市安群生物工程有限公司；采用磁微粒化學發光法測定Ⅳ型膠原(type Ⅳ collagen，Ⅳ-C)，試劑盒來自鄭州安圖生物工程股份有限公司。采用酶聯免疫發測定ROS，試劑盒來自上海仁捷生物科技有限公司，室溫血液20～25 ℃自然凝固10～20 min，離心20 min左右(2000～3000轉/min)，用無菌管仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心，使用ELISACalc軟件分析標準曲線。采用微板法測定GSH，試劑盒來自南京建成生物工程研究所，取待測樣本0.5 ml，加試劑一應用液2 ml混勻，3500～4000轉/min離心10 min，取上清液1 ml進行顯色反應，按步驟加入樣本和試劑，混勻，靜置5分鐘，420 nm波長，1 cm光徑，比色測定各管吸光度值。均嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 觀察指標收集臨床資料，比較兩組肝功能(ALT、AST、TBIL、ALB)、肝纖維化指標(HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C)及血清ROS、GSH水平。評估血清指標單獨及聯合檢測對PBC的診斷價值，分析PBC患者血清ROS、GSH水平與相關生化指標之間的相關性。

1.4 統計學方法應用SPSS 18.0統計學軟件分析數據。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗；經受試者工作曲線(ROC)評估血清指標單獨及聯合檢測對PBC的診斷價值。并采用Pearson相關分析PBC患者血清ROS、GSH水平與相關生化指標之間的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組肝功能指標比較觀察組ALT、AST、TBIL水平高于健康對照組，ALB水平低于健康對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組ALT、AST、TBIL、ALB水平比較

2.2 兩組肝纖維化指標比較觀察組HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C水平高于健康對照組，血清ROS、GSH水平高于健康對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組肝纖維化指標及血清ROS、GSH水平比較

2.3 血清指標診斷效能評估單獨檢測及聯合檢測血清ROS、GSH水平均可作為診斷PBC的效能指標(P<0.05)，見表3及圖1。

圖1 血清ROS、GSH單獨及聯合檢測診斷PBC的ROC圖

表3 血清ROS、GSH水平對PBC的診斷效能

2.4 相關性分析PBC患者血清ROS水平與ALT、AST、TBIL、HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C指標呈正相關(P<0.05)，GSH水平與ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C指標均呈負相關(P<0.05)。見表4。

表4 PBC患者血清ROS、GSH水平與疾病相關生化指標的相關性分析

3 討論

現代醫學認為PBC患者伴有不同程度的肝功能受損，因小葉間膽管炎癥反應導致膽汁淤積，門管區淋巴細胞浸潤，而引起肝細胞損傷，并發展為肝纖維化及肝硬化，甚至肝衰竭等，臨床治療則以改善肝功能、減輕肝纖維化程度為主[9]。本文結果中，觀察組ALT、AST、TBIL、HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C水平較健康人異常升高，而ALB水平明顯降低，則證實PBC患者確存在肝纖維化進展。

PBC是一類病因不明的肝臟炎性疾病，美國肝病學會認為診斷PBC需依靠影像學顯示肝功能改變、實驗室指標檢測膽紅素升高、線粒體抗體陽性等并具有相應病理學及臨床癥狀表現來綜合評估[10]。研究發現，早期PBC患者無特征性抗體陽性，且臨床癥狀不明顯，較易與慢性肝炎等其他肝臟疾病混淆，因此盡早做肝穿刺病例檢查是早期診斷PBC的金標準[11]。但考慮病理學穿刺活檢檢查有創，不利于推行，而隨著研究的不斷深入，諸多血清學指標與PBC發病的相關性得到關注，通過早期檢測血清學指標不僅可為臨床解釋PBC發病機制提供依據，且還可在一定程度上輔助早期診斷[12]。本研究選取血清ROS及GSH指標，作為早期診斷PBC的依據，結果發現觀察組血清ROS、GSH水平異常升高，且經ROC曲線分析，其可作為臨床診斷PBC的血清指標，聯合檢測的敏感度及特異度可達85.00%及66.94%，表明早期檢測血清ROS、GSH水平可在一定程度上幫助臨床醫師判斷疾病。

另外，相關性分析發現，PBC患者血清ROS、GSH水平與部分肝功能及肝纖維化指標具有一定關聯，提示當機體發生肝硬化或肝纖維化時，肝臟細胞發生腫脹變性或壞死，而血清ROS、GSH指標則參與其病變，部分指標之間無相關性可能與樣本量較少有關，又或者肝功能損傷受諸多因素影響，血清指標的檢測具有一定局限性。血清ROS、GSH指標與ALT、AST、HA、LN等指標具有相關性可能是因為，肝損傷將引起細胞外基質沉積，并改變其生理狀態，且隨著損傷加重，可引發肝纖維化的形成，并進一步導致肝硬化[13]。PBC患者體內伴有強烈的氧化應激反應，對核酸、蛋白質、脂類等的合成造成一定破壞。而ROS由線粒體中的電子傳遞鏈及蛋白質合成，是機體抵御外界病原體入侵的第一道預防機制，但當肝損傷后，氧化應激反應嚴重，激活的庫普弗細胞及浸潤中性粒細胞則可導致ROS水平異常升高，而過量的ROS又可加劇炎癥反應，導致肝功能進一步惡化。GSH是一種在肝臟內合成的硫醇和三肽分子，屬于抗氧化劑的一種，廖攀等[14]發現其可有效降低中性粒細胞內的ROS水平，兩者具有互相制約、互相影響的關系。肝臟對GSH周轉及器官間的水平穩態具有重要意義，而肝功能損傷后可引起內源性利用失衡，進而導致過度消耗，氧化應激反應可抑制GSH還原酶功能，進而導致氧化性GSH累積，降低機體抗氧化能力，進而表現出水平升高的情況。董亞芬等[15]發現，肝纖維形成過程中血清ROS及GSH異常升高，與本研究結果較為一致。

綜上所述，PBC患者血清ROS、GSH水平異常升高，可能參與肝細胞損傷及肝纖維化形成，可作為臨床早期診斷的重要指標，具有一定意義。本研究不足之處在于，在選取疾病相關生化指標時不夠詳細，未納入免疫指標等，且因樣本地區限制等，樣本量較少，使結果具有一定局限，有待后期加強后再次探究。