β-谷甾醇及其衍生物的溶解性特征及抗抑郁活性研究

曹馨元，劉曉峰，尹永霞，王 波，黃文華

β-谷甾醇(Sit)屬于植物甾醇，植物甾醇主要包括β-谷甾醇、豆固醇、菜油甾醇，是穩定植物細胞膜磷脂雙層的必需類固醇分子，具有多種生物活性[1-2]。植物甾醇在體內具有多種健康益處，尤其是針對各種慢性疾病的保護，例如心血管疾病、糖尿病、癌癥和肝損傷。植物甾醇由于其眾所周知的降低膽固醇的特性而引起了人們的極大興趣[3-4]，但是純植物甾醇不溶于水，也幾乎不溶于油脂，甚至在較高濃度的液體介質中容易形成晶體，在很大程度上限制了其進一步開發和利用。本項目組通過酯化修飾[5]了Sit的化學結構，開展了Sit及其衍生物的溶解性質和脂水分配系數測定實驗研究，并且通過小鼠懸尾應激和強迫游泳實驗[6-8]，初步評價Sit及其衍生物的抗抑郁活性，為其抗抑郁作用藥效物質基礎研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料:Sit及其衍生物(實驗室自制，純度大于 98%)；瑞波西汀(規格：50 mg/瓶，上海源葉生物科技有限公司，LOT：P03M6D12653)；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。高效液相色譜儀(北京創新通恒科技有限公司，CXTH-3000)；離心機(美國BECMAN公司，Avanti TM J-301)；氮吹儀(極恒實業有限公司，JHD-001)；漩渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，XW-80A)；數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ-250B)；恒溫干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司，DHG-9140A)。

1.2 實驗動物:成年雄性ICR小鼠112只(體重18～20 g)，飼養條件(溫度 23±2 ℃，相對濕度 50%±10%，12 h光照/暗循環，早上7:00開燈)，自由攝食及水。適應1周后，隨機分為空白對照組(10%丙二醇溶液)，陽性對照組瑞波西汀(Reboxetine)、β-谷甾醇(Sit)、山梨酸 Sit 酯(Sit-Sr)、苯丙氨酸-Sit 酯(Sit-P)、2-四氫糠酸-Sit 酯(Sit-T)、水楊酸-Sit 酯(Sit-S)，每組8只，2.5mg/kg。各組小鼠均腹腔注射給藥，給藥體積均為1.0 mL。給藥1 h后，各取1批小鼠分別進行懸尾實驗和強迫游泳實驗。

1.3 方法

1.3.1 Sit及其衍生物的溶解度測定[9]:將Sit及其衍生物分別加入到一定體積的水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿和石油醚中。振蕩混合5 min后超聲10 min，靜置，30 min內無可見的溶質顆粒，則認為完全溶解。

1.3.2 Sit及其衍生物的脂水分配系數測定

1.3.2.1 溶劑預飽和及樣品的制備[10]:將正辛醇與蒸餾水置于恒溫搖床振蕩24 h使其飽和，靜置，待兩相分離完全后，將蒸餾水飽和的正辛醇配制成濃度為1.0 mg/mL、0.01 mg/mL的Sit及其衍生物溶液。

1.3.2.2 色譜條件:反相C18 色譜柱(100 × 2.1 mm，3.5 μm)，柱溫40 ℃；流動相：甲醇-乙腈(30∶70，v/v)，流速0.5 mL/min，檢測波長210 nm，進樣量5 μL。

1.3.2.3 Sit及其衍生物標準曲線的制備:用甲醇分別配制0.5 mg/mL的Sit及其衍生物的標準母液，并稀釋得濃度為5 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的標準溶液。并以對照品濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，得線性回歸方程。

1.3.2.4 精密度實驗:按照上述色譜條件，分別吸取100 μg/mL的Sit及其衍生物標準溶液，分別連續進樣6次，測定并計算獲得RSD。

1.3.2.5 穩定性實驗:按照上述色譜條件，于0、2、4、6、8 h分別測定1.0 mg/mL的Sit及其衍生物的正辛醇(二次蒸餾水飽和的)溶液，0.01 mg/mL的Sit及其衍生物的二次蒸餾水(正辛醇飽和的)溶液的峰面積，并計算獲得其RSD。

1.3.2.6 脂水分配系數的測定及計算:10 mL的1.0 mg/mL的Sit及其衍生物的正辛醇溶液與10 mL二次蒸餾水溶液混合，25 ℃振搖48 h，分離有機相和水相，檢測兩項中的Sit及其衍生物的濃度，每個樣品平行測定3次。按下式計算正辛醇/水分配系數，lg P = lg(Co/Cw)，式中Co為正辛醇相中的濃度，Cw為水相中的濃度。Sit及其衍生物在正辛醇/水中的脂水分配系數測試結果見表4。

1.3.3 β-谷甾醇及其衍生物抗抑郁活性篩選研究[11]

1.3.3.1 小鼠懸尾應激實驗(TST):實驗小鼠腹腔注射給藥1 h后，尾巴懸掛固定于離地約45 cm桿上，使其頭部朝下并呈倒懸狀，觀察并記錄小鼠四肢靜止不動時的時間。

1.3.3.2 小鼠強迫游泳實驗(FST):將實驗小鼠放置于一透明水桶內，水溫控制在25±2℃。待小鼠入水后開始計時，總共6 min，記錄后4 min內小鼠的持續不動時間(s)。

2 結果

2.1 Sit及其衍生物的溶解度測定結果:由表1中的實驗結果可知，對Sit進行酯化衍生化處理可以增加其脂溶性。在石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯有機溶劑中，Sit-Sr的溶解度大于Sit-S、Sit-P和Sit-T；而在甲醇和乙醇中，Sit-S的溶解度大于Sit-Sr、Sit-P和Sit-T。

表1 Sit及其衍生物的溶解度

2.2 Sit及其衍生物的脂水分配系數測定結果

2.2.1 線性關系考察:表2的線性考察結果顯示，Sit在0.00512～0.512 mg/mL、Sit-Sr在0.00508～0.508 mg/mL、Sit-P在0.00524～0.524 mg/mL、Sit-T在0.00511～0.511 mg/mL、Sit-S在0.00531～0.531 mg/mL范圍內具有較好的線性關系。

表2 標準曲線測定結果

2.2.2 精密度及穩定性考察:由表3結果顯示，RSD均小于2%，表明儀器精密度良好，且正辛醇和二次蒸餾水中的各化合物在8h內穩定。

表3 精密度及穩定性結果(RSD)

2.2.3 脂水分配系數的測定及計算結果:由表4可知，在Sit的衍生物中，因甾體母核的C-3位發生了酯化反應，并接入羧酸類物質形成了酯鍵，所以整體Sit的酯化衍生物中除Sit-P外的lg P值均大于Sit 的lg P值，其中Sit-Sr與Sit-S的lg P相近，大于Sit-T、Sit、Sit-P。這進一步說明，隨著因酯化反應脂肪連或環的引入，使得Sit衍生物的脂溶性進一步增大。

表4 Sit及其衍生物的脂水分配系數測定結果(n=3)

2.2.4 脂水分配系數的測定及計算結果:由表5可知，TST指標經單因素方差分析，7組差異有統計學意義(F=106.435)，進而采用LSD法兩兩比較發現，Reboxetine、Sit、Sit-T、 Sit-P、Sit-Sr、Sit-S組與空白對照組的差異均有統計學意義(P<0.05)，Sit、Sit-T、 Sit-P、 Sit-S組與Reboxetine對照組的差異均有統計學意義(對應的t值分別為7.569、7.874、2.809、4.423)。FST指標經單因素方差分析，7組差異有統計學意義(F=33.476)，進而采用LSD法兩兩比較發現，Reboxetine、Sit、Sit-T、 Sit-P、Sit-Sr、Sit-S組與空白對照組的差異均有統計學意義(P<0.05)，Sit、Sit-T、 Sit-P、Sit-Sr、Sit-S組與Reboxetine對照組的差異均有統計學意義(P<0.05)。可認為在劑量為2.5 mg/kg時，與Sit、Sit-T、 Sit-P、Sit-Sr給藥組相比，Sit-S給藥組小鼠在懸尾應激實驗及強迫游泳實驗中的不動時間最短，表現出較顯著的抗抑郁活性。

表5 Sit及其衍生物在TST和FST中的抗抑郁作用

3 討論

β-谷甾醇作為植物甾醇的一種，在降低血清膽固醇水平、抗高血脂癥、預防心血管疾病、抗癌、抗炎和免疫調節等方面有較好的生物活性，但溶解特性極大限制了其應用和發展。項目組前期通過酯化修飾了Sit的化學結構，得到了Sit-T、Sit-P、Sit-Sr、Sit-S四種酯化衍生物。通過溶解性質和脂水分配系數測定實驗，得出Sit-S和Sit-Sr的溶解性和lg P值均強于Sit及其他衍生物。通過小鼠懸尾和強迫游泳實驗對Sit及其衍生物的抗抑郁作用進行了初步評價，得出Sit-S可顯著縮短小鼠懸尾的不動時間和強迫游泳不動時間，進一步說明酯化修飾可使脂溶性增強，從而更易通過血腦屏障發揮抗抑郁活性。為了驗證Sit的酯化衍生物是否可以通過提高其脂溶性，改變其藥代動力學特征及分布和排泄特性，還需要進一步進行實驗分析。