YAP蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況及臨床意義的研究

李西梅，羅 明，呼圣娟，王鵬達(dá)，張 淼，于曉兵，劉建芳，白飛虎

近年來，結(jié)直腸癌患者發(fā)病率逐年升高，結(jié)直腸癌的早診早治是當(dāng)前研究的熱點與難點。結(jié)直腸癌患者預(yù)后評估的手段較為有限。國內(nèi)外文獻[1-2]均表明，YAP(Yes-associated protein)蛋白，又稱Yes激酶相關(guān)蛋白，參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞遷移和入侵，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中有重要的意義。YAP蛋白有望成為結(jié)直腸癌早診早治的生物標(biāo)記物。本研究通過檢測YAP蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，明確YAP蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。探討YAP蛋白的陽性表達(dá)對于結(jié)直腸癌患者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料:收集2015年1月-2017年1月期間在我院確診為結(jié)直腸癌的患者80例(結(jié)直腸癌組)并收集癌塊組織，同時收集癌旁組織的石蠟塊80例(癌旁組)；采用結(jié)腸鏡檢查正常的體檢人群的結(jié)直腸黏膜石蠟塊80例(健康人群組)。確保入組結(jié)直腸癌組織在石蠟包埋前均未進行化療與放療，所有病例均為結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤，且已排除患嚴(yán)重的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾患。所有入組對象均由本人或委托人簽署倫理委員會通過的知情同意書。入組的結(jié)直腸癌組與癌旁組中，男性42例，女性38例，平均年齡(52±4.5)歲。選擇健康體檢者80例作為對照組，其中男性40例，女性40例，平均年齡(50±6.1)歲。3組資料進行方差齊性檢驗，資料具有可比性(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 調(diào)取病例資料：電話隨訪核對入組者基本信息，包括性別、年齡。結(jié)直腸癌組病例登記腫瘤直徑、病理分化程度、TNM分期，記錄3年生存時間。

1.2.2 免疫組化法檢測:YAP蛋白的表達(dá)。對收集的石蠟塊進行切片，之后行HE染色再次確認(rèn)診斷。本研究中主要試劑YAP兔抗人多克隆抗體購自博奧森公司。將石蠟切片進行脫蠟、水化，按照免疫組化抗體說明書操作，3%過氧化氫30 min 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，使用pH6.0的0.01M檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復(fù)。正常山羊血清作為一抗，37 ℃孵育20 min。稀釋抗YAP多克隆抗體至工作濃度1∶150,抗YAP多克隆抗體4 ℃過夜，之后進行DAB染色、復(fù)染、脫水、透明，最后封片后顯微鏡下判讀。所有切片結(jié)果均由兩名病理科副主任醫(yī)師經(jīng)培訓(xùn)后判讀。判讀的參考標(biāo)準(zhǔn)[3]綜合考慮了染色程度和染色細(xì)胞百分比。依照染色程度，未染色判斷為0分，淡黃色判斷為1分，棕黃色判斷為2分，棕褐色判斷為3分。依照染色細(xì)胞百分比，每例切片隨機選5個高倍視野,將陽性細(xì)胞數(shù)與同類細(xì)胞數(shù)進行百分比，選取百分比的平均值，如平均百分比<5%則判斷為0；5%～25%判斷為1；25%～50%判定為2；平均百分比>50%判定為3。將染色程度與染色細(xì)胞平均百分比所得分?jǐn)?shù)相乘，得分≥2為陽性，<2為陰性。

2 結(jié)果

2.1 YAP蛋白在組織中的表達(dá)情況:YAP蛋白在結(jié)直腸癌組織胞漿和胞核中均呈陽性表達(dá)，顯微鏡下為棕黃色，見圖1(目錄后)。其在癌旁組織和正常腸黏膜組織中多為陰性表達(dá)，見圖2、圖3(目錄后)。YAP蛋白在結(jié)直腸癌組、癌旁組織組以及健康人群組中的陽性表達(dá)率見表1。結(jié)直腸癌組、癌旁組以及健康人群組的陽性表達(dá)率進行χ2檢驗，χ2值為39.341,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示3組之間的YAP陽性表達(dá)率不同。分別進行組間比較，結(jié)直腸癌組與癌旁組，結(jié)直腸癌組與健康人群組的YAP陽性表達(dá)率均不同，其χ2值分別為25.664、30.861(P<0.05)，而癌旁組與正常腸黏膜組比較，χ2值為0.295(P>0.05)。

表1 結(jié)直腸癌、癌旁、健康人群中YAP蛋白表達(dá)情況的比較[n(%)]

2.2 YAP蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系:不同性別、年齡、腫瘤直徑組的結(jié)直腸癌組織中YAP蛋白的表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同TNM分期、病理分化程度組的結(jié)直腸癌組織中YAP蛋白陽性表達(dá)率不同(P<0.05)，見表2。

表2 不同臨床病理特征分組中結(jié)直腸癌組織的YAP蛋白表達(dá)情況的比較[n(%)]

2.3 YAP蛋白的表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性:電話隨訪中，結(jié)直腸癌組有21例死亡，其中YAP陽性者19例，YAP陰性者3例。統(tǒng)計分析入組結(jié)直腸癌患者平均生存期為29.638月，標(biāo)準(zhǔn)誤為1.228，95%的可信區(qū)間為27.231～32.044。Kaplan-Meier法又稱乘積極限法，該法可繪制YAP陰性組與陽性組的結(jié)直腸癌患者的生存函數(shù)曲線(見圖4，目錄后)，圖中顯示隨著時間的增加，生存率是下降的。Kaplan-Meier法進行時序檢驗，統(tǒng)計量為4.209，P值為0.04(P<0.05)，說明兩條曲線的生存率不同。從YAP陰性組與陽性組結(jié)直腸癌患者的生存分析函數(shù)曲線圖可看出，YAP陰性組曲線始終在YAP陽性組的曲線之上，說明YAP陰性組患者三年生存率高于YAP陽性組。

3 討論

YAP蛋白(Yes-associated protein)[4]最初在1994年被鑒定為非受體酪氨酸激酶YES1的結(jié)合蛋白。YAP蛋白是一種轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，是Hippo途徑的下游效應(yīng)分子。Hippo/YAP信號通路[5]是維持細(xì)胞極性的重要途徑，是組織穩(wěn)態(tài)、器官大小和干細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子。YAP蛋白在小細(xì)胞肺癌、胃癌、食管鱗癌等各種腫瘤中異常表達(dá)，包括結(jié)腸直腸癌。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)[6]YAP靶基因的表達(dá)升高是5-FU耐藥細(xì)胞的主要變化，故提出YAP信號在結(jié)直腸癌耐藥過程中也有重要意義。

YAP蛋白[7]在結(jié)直腸癌進展的不同狀態(tài)中具有致癌和抑癌的雙重作用機制。部分研究[2]支持YAP的高表達(dá)與腫瘤進展和降低生存率有關(guān)。因此，YAP有可能成為結(jié)直腸癌的腫瘤生物標(biāo)志物或治療靶點。然而，部分研究[8]顯示，YAP作為腫瘤抑制因子的矛盾作用，顯示其抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生，參與促進細(xì)胞凋亡，抑制腸干細(xì)胞的維持和炎癥活性。本研究顯示，YAP蛋白在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)。其表達(dá)陽性率與腫瘤分期、分化程度有關(guān)。陳海濱等人[9]研究發(fā)現(xiàn)，YAP蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌組織的大小、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移 Dukes 分期有關(guān)，兩者表達(dá)呈正相關(guān)。但在本研究中YAP蛋白的表達(dá)與腫瘤組織的直徑并無明顯關(guān)系，故仍需大樣本的研究進一步證實。

文獻資料表明[10]YAP蛋白在老年胃癌組織中的表達(dá)異常升高,且與胃癌患者預(yù)后不良相關(guān)。本研究經(jīng)采用Kaplan-Meier法比較YAP蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的生存率具有統(tǒng)計學(xué)差異，YAP陰性組結(jié)直腸癌患者三年生存率高于YAP陽性組。YAP蛋白的表達(dá)情況對于結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評估有一定參考意義，在一定程度上能夠指導(dǎo)臨床上制定個體化診療方案。YAP蛋白在結(jié)直腸癌中的作用機制較為復(fù)雜。高振文等[1]應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)直腸癌原發(fā)灶及其多器官轉(zhuǎn)移灶中YAP及N-鈣黏蛋白的表達(dá),應(yīng)用qRT-PCR和Western blotting檢測YAP、N-鈣黏蛋白及E-鈣黏蛋白在6種結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，進而推測YAP蛋白能夠通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,促進結(jié)直腸癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移。因YAP蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞核中常呈過表達(dá)，故有研究[5]推測YAP介導(dǎo)的結(jié)腸癌調(diào)控的分子機制與YAP蛋白磷酸化和亞細(xì)胞定位有關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn)[11]Glut3-YAP信號通路的激活可以作為主激活因子來重新編程癌癥的代謝，從而促進轉(zhuǎn)移，提出YAP蛋白可參與腫瘤代謝的重編程。目前對于YAP蛋白在結(jié)直腸癌發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等的具體作用機制仍需進一步研究。