血清生長分化因子-15、SYNTAX評分在急性冠脈綜合征中的相關性及對患者心血管事件的作用和機制研究

馬宇凌，謝 忠，劉彥武，周 偉，張 磊，李 娜，楊學龍，張卓豪，王 靜

急性冠狀動脈綜合征(ACS)是心血管疾病主要的危急癥，具有較高的發病率和致死率，主要的發病機理是冠狀動脈粥樣硬化和斑塊的形成，而這也與冠狀動脈疾病的預后密切相關，單核、巨噬細胞的激活在動脈粥樣硬化和斑塊形成中起著重要作用，參與了冠狀動脈疾病的進展，篩選生物標志物作為預后評估的工具具有重要的潛在預防和治療意義[1]。生長分化因子-15(GDF-15)是一種相對較新的生物標記物，是轉化生長因子β(TGF-β)超家族中的一種蛋白，由心肌細胞和活化的巨噬細胞產生和分泌[2]。單核、巨噬細胞的激活與冠狀動脈粥樣硬化的發病密切相關[3]，因此研究GDF-15預測未來主要心血管不良事件(MACE)風險至關重要。研究證實，SYNTAX評分與不同疾病嚴重程度患者的MACE相關[4]。TGF - β RI/Smad是TGF-β信號下游的重要調節信號[5]。因此，本文主要研究GDF-15與SYNTAX評分在非ST段抬高急性冠脈綜合征(NSTEACS)患者MACE風險預測的相關性，并探討可能的調節機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2017年1月-2019年12月我院心內科收治的NSTEACS且至少有1處狹窄>50%的患者104例，其中男性58例，女性46例，平均年齡(61.20±10.56)歲。排除既往心肌梗死史、冠狀動脈搭橋術史、全身炎癥史、肝腎功能衰竭和患有惡性疾病。本研究經過醫院倫理委員會同意，患者均知情并簽訂知情同意書。

1.2 儀器和試劑：酶標儀 (SPECTE RAmax190，Thermo Fisher公司)；CFX-96 PCR系統(Bio-Rad，Hercules，CA，美國)；GDF-15和IL-1β的ELISA試劑盒購自于Elabscience公司。

1.3 研究方法:入院當日收集臨床資料，包括年齡、性別、心血管危險因素，收集冠狀動脈造影、生化指標及出院時的藥物治療情況。入院次日清晨抽取空腹靜脈血，離心收集血清，置于-80 ℃保存；正常體檢者體檢當日采集空腹靜脈血，離心收集血清，置于-80 ℃保存。

采用ELISA 法檢測血清中GDF-15和IL-1β水平，實驗過程嚴格按照試劑盒使用說明進行。血清進行倍比稀釋，配制標準品并繪制出標準曲線，加入生物素化抗體100 μL/孔，室溫孵育60 min；辣根過氧化物酶標記液100 μL/孔，室溫避光孵育20 min，顯色劑溶液100 μL/孔，室溫避光孵育20 min；終止液50 μL/孔，混勻后立即測量A450值。根據所繪制的標準曲線，計算所測樣品的含量，并進行統計分析。

實時熒光定量 PCR(qPCR)檢測TGF-RI/Smad信號表達情況，使用TRIzol試劑提取血液中的總mRNA。使用逆轉錄試劑盒對500 ng總RNA進行反轉錄，并將合成的 cDNA與熒光染料一起用于實時聚合酶鏈反應。采用CFX-96 PCR系統(Bio-Rad，Hercules，CA，美國)進行cDNA的PCR擴增。引物序合成由生工生物工程(上海)股份有限公司進行。使用 2-ΔΔCt方法評估mRNA的相對轉錄水平。所有實驗均重復三次。引物:TGF-RI:forward，5′-TAGCAGCAGACAATAAAGACA-3′，reverse，5′-ATGTGAAGATGGGCAAGACC-3′；Smad2:forward，5′-GCCCTTGAAAGTTCTTACCT-3′，reverse，5′-TCAATCCCAGGCACTTTAGG-3′；Smad3:forward，5′-CACATTGACTGGGAAACCTG-3′，reverse，5′-CTGAGATGTTTCCCTTCTGG-3′；-actin:forward，5′-GCCTTCCTTCTTGGGTAT-3′，reverse，5′-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3′。

根據冠狀動脈疾病定義(至少1條冠狀動脈狹窄>50%)，通過評估冠狀動脈狹窄程度>50%和直徑>1.5 mm的每個病變的總分，計算每個患者的SYNTAX總分[6]。在接受經皮冠狀動脈介入治療(PCI)的NSTEACS患者中，所有患者服用300 mg阿司匹林治療，PCI時服用600 mg氯吡格雷。術后服用阿司匹林100 mg/d；氯吡格雷75 mg/d，共1年。

進行出院后兩年隨訪，根據是否存在MACE對患者進行分層，分析MACE(即心血管死亡、非致命性心肌梗死或不穩定心絞痛再入院的綜合結果，隨訪再住院或死亡情況)風險預測中GDF-15和SYNTAX評分之間的關系，并分析GDF-15和IL-1β炎癥指標在NSTEACS風險預測中的作用。

2 結果

2.1 一般臨床資料分析:一般臨床資料分析見表1。

表1 104例NSTEACS患者的一般資料分析

2.2 NSTEACS患者合并心血管事件的比較分析：共有104例NSTEACS患者被納入研究。在2年的隨訪中，31例患者(29.81%)合并心血管事件。患者的臨床、血管造影和生化特征如表2所示，根據有無心血管事件分類，單因素分析顯示SYNTAX評分(P<0.05)、IL-1β(P<0.05)和GDF-15血清濃度(P<0.05)差異具有統計學意義(P<0.05)。GDF-15三分位法后的Kaplan-Meier生存曲線顯示：與最低的三分位數相比，最高三分位數的參與者有更高的MACE發生率。

表2 104例NSTEACS患者合并心血管事件的比較分析

變量有(n=31)無(n=73)P值左心室射血分數(%,x±s)54.12±7.6656.11±8.23>0.05肌鈣蛋白I(ng/mL,x±s)37.13±21.5032.55±19.54>0.05紅細胞壓積(%,x±s)38.77±6.4339.65±5.22>0.05血紅蛋白(mg/dl,x±s)13.2±3.5913.7±5.61>0.05白細胞(109/L,x±s)11.21±2.449.54±3.18>0.05總膽固醇(mg/dL,x±s)172.51±22.67171.39±32.89>0.05肌酐(mg/dL,x±s)1.12±0.530.93±0.42>0.05GDF-15(pg/mL)3261.51[2450～5680]1987.89[1323～2489]<0.05IL-1β1392.77[823-1922]388.10[122-611]<0.05SYNTAX評分26[24-31]19[15-22]<0.05治療[n(%)] 阿司匹林31(100)73(100)>0.05 氯吡格雷26(83.87)61(83.56)>0.05 他汀類31(100)73(100)>0.05 ACEI24(77.42)55(75.34)>0.05 -阻滯劑25(80.65)62(84.93)>0.05 抗糖尿病藥物11(35.48)23(31.51)>0.05

2.3 NSTEACS患者血清中GDF-15與SYNTAX評分的相關性分析:結果顯示，GDF-15與SYNTAX評分呈中度正相關(r=0.41，P<0.05)。在GDF-15患者中，GDF-15患者發生心血管死亡、非致命性心肌梗死或因不穩定心絞痛再次入院的主要轉歸發生率為49.04%(51/104)。

2.4 NSTEACS患者的多因素預測因素分析：結果顯示，在Cox回歸分析中，GDF-15水平(P<0.05)、IL-1β(P<0.05)和SYNTAX評分(P<0.05)是獨立預測因子，見表3。與SYNTAX評分的回歸模型相比，附加GDF-15分析后顯示Harrell's C顯著增加(Harrell's C由0.82增加至0.91)，而Akaike信息準則顯著減少(由1207減少至1012)。

表3 104例NSTEACS患者的多因素預測因素分析

2.5 GDF-15、SYNTAX評分和IL-1β的ROC曲線：GDF-15曲線下面積(AUC)高于IL-1β曲線下面積(P<0.05)，SYNTAX評分差異無統計學意義(P>0.05)。

2.6 TGF- RI/Smad的mRNA表達比較：根據GDF-15表達的三分位法將患者分為3組，分別檢測TGF- RI、Smad2、Smad3的mRNA表達。結果表明，GDF-15高表達組和中表達組TGF- RI、Smad2、Smad3的mRNA表達明顯高于GDF-15低表達組(P<0.05)。GDF-15高表達組TGF- RI、Smad2、Smad3的mRNA表達明顯高于中表達組(P<0.05)。

3 討論

急性冠狀動脈綜合征包括不穩定型心絞痛，非ST升高的心肌梗塞(NSTEMI)和ST升高的心肌梗塞(STEMI)，其中NSTEACS是一種常見的心血管疾病，是心肌梗死最嚴重和最致命的形式之一，嚴重威脅患者的生命安全[7]。

SYNTAX評分是一種基于病變的血管造影評分系統，已廣泛用于對冠狀動脈疾病的復雜性進行評分，量化病變的嚴重程度，并預測不良的心血管后果[8]。研究顯示，患者具有相對較高SYNTAX評分，有更差的心血管結局是MACE經皮冠狀動脈介入治療的獨立預測因子[9]。與其他研究結果一致，我們發現SYNTAX評分可以預測NSTEACS患者2年隨訪期間的不良心血管事件。

GDF-15是TGF-β細胞因子超家族的成員，該家族成員在健康條件下表達較弱，但能夠因響應氧化應激、炎癥和組織損傷而產生，是急性冠脈綜合征患者的一個預后標志物[10]。與穩定型心絞痛患者相比，NSTEACS患者的冠狀動脈斑塊具有更廣泛的巨噬細胞浸潤[11]。GDF-15的循環濃度在動脈粥樣硬化中的濃度增加，是未來心血管事件的重要預測因子[12]。在梗死的心肌中檢測到GDF-15的表達，高水平的GDF-15與在NSTEACS死亡或心肌梗死的風險增加有關[13]。我們的研究與其他結果類似，高水平的GDF-15與隨訪2年后的心血管事件相關。

此外，我們發現SYNTAX評分與GDF-15水平呈顯著正相關。我們的研究發現，除了SYNTAX評分、IL-1β和GDF-15血清濃度差異具有統計學意義外，其他因素與NSTEACS患者心臟不良事件的發生之間沒有顯著的相關性。這可能是由于本研究是觀察隊列研究，不能排除未測量變量中的混雜因素，且有限的患者數量可能會影響統計分析。

GDF-15是TGF-β超家族中的一種蛋白，由心肌細胞和活化的巨噬細胞產生和分泌，而TGF - β RI/Smad是TGF-β信號下游的重要調節信號，并參與了NSTEACS的發生發展[14]。在本研究中，我們發現低表達GDF-15患者中TGF- RI、Smad2、Smad3的mRNA表達較低，而高表達GDF-15患者中TGF- RI、Smad2、Smad3的mRNA表達明顯增高。這提示TGF- RI/Smad信號在GDF-15參與NSTEACS疾病中發揮著作用，研究明確了TGF-β能調節TGF- RI/Smad信號通路[15]，我們可以提出GDF-15可能通過調節TGF - β RI/Smad信號參與了NSTEACS疾病的發展。

總之，NSTEACS患者入院時GDF-15水平與SYNTAX評分相關，并且在2年隨訪期間與MACE風險增加獨立相關，可能通過調節TGF-β RI/Smad信號發揮作用。為NSTEACS診斷及治療提供了一定的依據。