釓噴替酸葡甲胺對軟骨細胞凋亡及自噬的影響

焦華杰，宋 濤，于 芝，王琰娟，饒慧敏

隨著核磁共振(MR)技術的發展及其影像學診斷獨特的優勢，目前MR在臨床的應用越來越廣泛。釓噴替酸葡甲胺是常用的MR掃描對比劑，長期以來被認為在推薦劑量下是安全的,然而越來越多的證據表明，釓并不能完全從體內清除,一些釓劑持續存在于人體組織細胞中[1]。MR直接法關節造影在關節損傷診斷方面應用廣泛[2]，但對比劑釓噴替酸葡甲胺局部注射對關節軟骨細胞是否會產生毒性影響，目前尚無文獻資料報道。本研究通過細胞實驗探討不同劑量釓噴替酸葡甲胺對人軟骨細胞的毒性及對人軟骨細胞凋亡及自噬的影響。

1 資料與方法

1.1 細胞培養及分組:人軟骨細胞購自北納生物，細胞培養采用DMEM/F12培養基+10胎牛血清+1%雙抗(青霉素+鏈霉素)，細胞每48h換液一次，細胞融合達到80%進行傳代培養,bcl2兔抗人蛋白抗體(12789-1-AP)、bax兔抗人抗體(50599-2-Ig)、lc3兔抗人抗體(14600-1-AP)、p62兔抗人抗體(18420-1-AP)、gapdh兔抗人抗體(10494-1-AP)購自武漢三鷹公司，cleaved-caspase3兔抗人抗體(9661)購自CST公司。實驗依據加入藥物濃度分為正常對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，各組細胞培養液中分別加入0 mmoL/L、0.5 mmoL/L、2 mmoL/L、10 mmoL/L釓噴替酸葡甲胺。

1.2 CCK8細胞增殖檢測:取對數生長期軟骨細胞，接種到96孔板中，每孔104個細胞，分別加入對應濃度藥物24 h 后，CCK8檢測各組細胞增殖率，每組重復3次。

1.3 細胞凋亡率檢測:取對數生長期軟骨細胞，分別加入對應濃度的釓噴替酸葡甲胺24h后，0.25%胰酶消化收集細胞，PBS離心洗滌3次(800 g，5 min，下同)，75%乙醇固定30 min，PBS離心洗滌3次，加入500 μL凋亡檢測工作液。避光孵育30 min后流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，每組重復3次。

1.4 Western blot檢測:各組細胞，0.25%胰酶消化后，PBS離心洗滌3次，加入500 μL預配置好的細胞裂解液，冰上裂解5 min，震蕩10 s，反復操作5次，12 000 g離心15 min，收集上清，BCA法檢測蛋白濃度，加熱煮沸5 min，配制SDS凝膠，每組加入30 μg蛋白，110 V恒壓電泳，300 mA恒流轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗工作液37 ℃孵育1 h(bcl2兔抗人抗體，1∶2 000；bax兔抗人抗體，1∶5 000；cleaved-caspase3兔抗人抗體,1∶1 000；lc3兔抗人抗體,1∶3 000；p62兔抗人抗體,1∶4 000；gapdh兔抗人抗體,1∶20 000)，TBST洗膜3次，加入二抗( HRP標記山羊抗兔二抗,1∶10 000)工作液37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL發光檢測，采用ImageJ軟件進行蛋白表達相對定量。

2 結果

2.1 CCK8細胞增殖檢測:各組細胞增殖檢測比較(F=7.350,P<0.05)，組間兩兩比較低劑量組(1.01±0.04)與正常對照組細胞(0.99±0.06)增殖率比較差異無統計學意義(t=0.507,P>0.05)，中劑量組(0.97±0.05)與正常對照組細胞(0.99±0.06)增殖率比較差異無統計學意義(t=1.144，P>0.05)，高劑量組(0.86±0.015)，與正常對照組比較，差異具有統計學意義(t=6.784，P<0.05)。

2.2 各組細胞凋亡率檢測:正常對照組細胞凋亡率為(1.17±0.15)%，低劑量組為(1.27±0.16)%，中劑量組為(1.20±0.20)%，高劑量組為(5.01±0.25)%，四組比較差異有統計學意義(F=297.44,P<0.05)。各組細胞凋亡率檢測比較，低劑量組、中劑量組細胞凋亡率與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，高劑量組與正常對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 各組細胞凋亡蛋白表達相對定量比較:Western blot檢測各組細胞凋亡蛋白表達，低劑量組、中劑量組與正常對照組比較，bcl2、bax、cleaved-caspase3蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，高劑量組與正常對照組比較，bcl2蛋白表達下調，bax、cleaved-caspase3蛋白表達上調，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組細胞凋亡蛋白表達相對定量比較

2.4 各組細胞自噬蛋白表達比較:Western blot檢測各組細胞自噬蛋白表達，低劑量組、中劑量組與正常對照組比較，lc3Ⅱ蛋白表達上調，差異有統計學意義(P<0.05)，p62蛋白表達下調，差異有統計學意義(P<0.05)；高劑量組與正常對照組比較，lc3Ⅱ蛋白表達下調，lc3 、p62蛋白表達上調，差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各組細胞自噬蛋白相對表達定量比較

3 討論

近年來MR關節造影在臨床應用越來越多，相關研究表明MR 關節造影對半月板撕裂的敏感性和特異性有明顯提高，檢查結果更接近關節鏡[3]。MR關節造影分為直接法和間接法，直接法是先向關節腔內注射MR對比劑，然后通過MR掃描觀察關節結構及病變。直接法膝關節MR造影可以通過擴大分離關節囊,能夠更加清晰顯示關節內部結構及病變，同時對于某些膝關節病變,如評價術后半月板是否再次損傷、膝關節游離體、評價關節軟骨退變、剝脫等方面,MR膝關節直接造影具有很高的診斷價值[4]。

釓噴替酸葡甲胺是常用的MR掃描對比劑，隨著研究的不斷深入，近年來關于釓增強劑應用的安全性越來越受到關注[5]，MR增強掃描后的組織細胞釓沉積對機體具有一定危害[6-7]，同時有相關資料顯示釓可在細胞中長期存在[8-9]。有研究表明[10]，小鼠孕期接受釓增強劑可同過胎盤沉積于幼鼠大腦組織，并對幼鼠腦發育產生影響。Beyazal Celiker F等研究表明臨床反復使用釓對比劑可使大鼠睪丸間質細胞凋亡增加，血清Ca2+水平升高，睪酮水平降低[11]。

骨組成細胞包括軟骨細胞、成骨細胞和骨細胞的細胞死亡，在骨骼的發育、維持和修復以及骨關節炎和骨質疏松的發病機制中起著重要作用。軟骨細胞的增殖、分化和凋亡是軟骨內成骨的重要步驟,軟骨細胞通過產生各種酶、細胞因子和基質相關蛋白來維持細胞外基質在降解和修復之間的功能平衡[12]，而廣泛的軟骨細胞死亡或功能障礙可導致關節損傷的進一步發展[13]。為此，在關節損傷診斷治療過程中應盡力保護關節軟骨細胞數量功能完整。

目前國內外常用釓噴替酸葡甲胺關節造影濃度為0.5 mmoL/L及2 mmoL/L[14]，也有文獻資料表明可應用到45 mmoL/L[15]。本次研究中通過比較不同濃度釓噴替酸葡甲胺對人軟骨細胞增殖、凋亡影響發現，0.5 mmoL/L、2 mmoL/L釓噴替酸葡甲胺對軟骨細胞增殖及凋亡無影響，但可促進細胞自噬相關蛋白lc3Ⅱ表達，提高細胞自噬能力。10 mmoL/L釓噴替酸葡甲胺能夠抑制人軟骨細胞增殖及自噬，通過上調促凋亡蛋白bax、cleaved-caspase3蛋白表達，抑制抗凋亡蛋白bcl2表達進而促進軟骨細胞凋亡。

綜上所述，本次研究表明低濃度釓噴替酸葡甲胺能夠促進人軟骨細胞自噬，而高濃度釓噴替酸葡甲胺能夠抑制人軟骨細胞增殖及自噬，促進軟骨細胞凋亡。雖然本次研究對釓噴替酸葡甲胺誘導人軟骨細胞凋亡的機制尚未闡明，但本次研究結果為臨床改善釓噴替酸葡甲胺進行MR關節造影提供了理論依據，臨床醫師在進行MR關節造影檢查時應嚴格把控釓噴替酸葡甲胺對比劑濃度，避免高濃度對比劑帶來的二次損傷。