靶向沉默Zwilch 對人皮膚惡性黑素瘤細胞增殖及凋亡的影響

楊景煜,顧珈榕，郭 靜，楊 瑞，王文成，李云鳳，徐 平，顧金海

皮膚惡性黑素瘤(CMM)是人類皮膚癌中惡性程度最高的腫瘤[1]，發展快、轉移早、易復發、預后差，目前的總體療效并不理想[2]，亟須進一步研究以尋求有效的治療靶點和方法。Zwilch是一種新近才被篩選出來的致癌基因，在CMM與正常組織之間表達差異極為顯著，且表達水平與CMM患者的病理分級、分期等均顯著相關，在CMM的臨床診治及預后評估方面極具潛在價值[3]。然而目前關于Zwilch的報道較少，作用機制仍未闡明。本研究以CMM細胞為對象，初步探討靶向沉默Zwilch 對其增殖和凋亡產生的影響，為進一步研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料：人皮膚惡性黑素瘤細胞A375購自中科院上海細胞資源中心，在含10%胎牛血清(美國HyClone)、1×105U/L青霉素(美國Sigma)、100 mg/L鏈霉素(美國Sigma)的DMEM培養液(美國Gibco)中于37 ℃、5% CO2條件下培養孵育，細胞系貼壁生長。分3組細胞進行實驗。對照組，常規條件培養的A375細胞；sh-NC(sh-Negative Control)組：感染sh-NC慢病毒的A375細胞；sh-Zwilch組：感染sh-Zwilch慢病毒的A375細胞。sh-NC、sh-Zwilch慢病毒均購自上海吉凱基因技術公司。感染時，選擇狀態良好的A375細胞，以5×104個/孔接種于12孔板，37 ℃、5% CO2培養至細胞融合度達到30%，按照MOI=2.0加入0.9 μL慢病毒，采用Normal+Polybrene的方式感染，培養24 h 后更換培養基，繼續感染72 h 后觀察慢病毒上報告基因GFP 的表達情況。

1.2 主要試劑材料：兔抗人Zwilch單克隆抗體購自英國Abcam公司，GAPDH 多克隆抗體(AB-P-R 001)購自杭州賢至生物科技有限公司。PCR試劑盒購自Promega公司，引物由上海生工合成。Western blotting相關試劑、Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒均購自南京凱基生物科技發展有限公司。CCK-8試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 實時熒光定量LPCR檢測mRNA表達：sh-RNA感染A375細胞72 h 后觀察GFP 熒光率大于80%者分于12孔板中培養，長滿后收集細胞，PBS清洗3次，依據操作手冊用TRIzol 試劑盒提取總RNA，用GoScriptTM Reverse Transcription System進行逆轉錄和 PCR 擴增。Zwilch引物序列：上游為5’-CGTCTCCTTCAGCTGATGTCC-3’，下游為5’-TGGTCCAACATTTTCGCCAGT-3’；GAPDH引物序列：上游為5’- CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’，下游為5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。PCR反應條件為95 ℃預變性30 s，然后95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，共35個循環后再72℃延伸6 min。以2-ΔΔCt值(Ct 代表循環閾值)表示Zwilch mRNA的相對表達量。每組實驗均重復5 次。

1.4 Western blotting檢測蛋白表達：sh-RNA感染A375細胞72 h 后觀察GFP 熒光率大于80%者分于6孔板中培養，長滿后收集細胞，加入預冷裂解液在冰浴中充分裂解細胞，提取全蛋白，BCA法分析定量。取10 μg總蛋白樣品，用10%的TrisGlycine膠進行 SDS-PAGE 電泳，并轉移至PVDF膜上，用TBST配制的牛奶封閉1 h，加入一抗(體積稀釋比為1∶3 000)4 ℃ 孵育過夜。其后用TBST洗膜5 min，用熒光二抗(體積稀釋比為1∶5 000)避光室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min 5次后用奧德賽(ODYSSEY CLx)曝光。掃描灰度并計算蛋白相應的表達量。每組實驗均重復5 次。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖：sh-RNA感染A375細胞72 h 后觀察GFP 熒光率大于80%者分于24孔板接種5×104個細胞，細胞懸液體積為1 mL，在37 ℃ 5%CO2培養箱中培養1～5 d 后，每孔加入100 μl CCK-8液，繼續在培養箱中孵育1 h，用酶標儀測定450 nm波長的吸光度(D450)。每組實驗均重復5 次。

1.6 Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡：sh-RNA感染A375細胞72 h 后觀察GFP 熒光率大于80%者分于6孔板中培養，長滿后收集細胞，PBS洗滌2次，2 000 rpm離心2 min，棄上清，加入500 μl binding buffer懸浮細胞，加入5 μl Annexin V混勻后，再加入5 μl PI混勻，室溫避光孵育15 min，用流式細胞儀進行檢測。每組實驗均重復5 次。

2 結果

2.1 shRNA慢病毒感染對A375細胞Zwilch mRNA及蛋白表達的影響：實時熒光定量PCR及Western blotting結果顯示，慢病毒感染72 h后，與對照組比較，sh-Zwilch組細胞的Zwilch mRNA及蛋白表達水平均顯著下降(P<0.05)，而sh-NC則無明顯影響。這表明shRNA慢病毒能夠靶向沉默人CMM 細胞A375中 Zwilch 的表達和作用，從而為后續實驗奠定基礎。

2.2 靶向沉默Zwilch對A375細胞增殖的影響：CCK-8結果顯示，慢病毒感染實現Zwilch靶向沉默后1 d ，sh-Zwilch組細胞的活性比對照組顯著降低(P<0.05)；其后隨時間延長到2～5 d 時，細胞活性的降低更加明顯(P<0.05)。這表明靶向沉默Zwilch能夠隨時間抑制A375細胞的增殖，從而為后續以Zwilch為靶點進行人皮膚黑素瘤靶向治療提供實驗依據。

2.3 靶向沉默Zwilch對A375細胞凋亡的影響：流式細胞檢測結果顯示，慢病毒感染實現Zwilch靶向沉默后，sh-Zwilch組細胞的凋亡率比對照組明顯增多(P<0.05)(圖1，目錄后)，表明靶向沉默Zwilch能夠促進人CMM 細胞A375的凋亡，為其機制研究提供依據。

3 討論

人皮膚惡性黑素瘤(CMM)是一種轉移早、發展快、治療難、預后差的高惡性腫瘤，瘤細胞的異常增殖是其突出的生物學特性，過程很復雜，但歸根結底是由腫瘤細胞的異常有絲分裂造成的[4-5]。研究表明，真核生物的細胞有絲分裂是一個精巧復雜的調控過程，必須由紡錘體組裝檢驗點(SAC)實時監控才能保證遺傳信息的平均分配[6]。而SAC系統則由主要成分(Mad1/2/3、BubR1、Bub1/3等)、動粒蛋白(RZZ復合體、Ndc80復合物等)、微管馬達(dynein、CENP-E等)及效應器(cdc20、APC/C等)四部分組成[7]。其中RZZ復合體主要由Rough Deal(Rod)、Zeste-white 10(Zw10) 和 Zwilch組成，在細胞有絲分裂中起著募集dynein/dynactin、Mad1-Mad2到著絲粒并促進受體結合，以保證有絲分裂正常進行的重要作用[8-11]。目前研究已經證實RZZ復合體與多種惡性腫瘤的發生密切相關[12]。

Zwilch是RZZ復合體中目前研究最少的一種成分，直到2002年才在果蠅中被發現[13]。我們的前期研究表明，Zwilch在CMM與正常組織之間表達差異極為顯著，且其表達水平與CMM患者的病理分級、分期等均顯著相關，在CMM的臨床診治及預后評估方面極具潛在價值[3]。因此本課題對靶向沉默Zwilch對CMM細胞增殖和凋亡的影響進行了基礎研究。結果顯示，通過shRNA慢病毒感染實現Zwilch靶向沉默后，A375細胞的細胞活性顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率明顯增多(P<0.05)。這些結果表明，靶向沉默Zwilch能夠抑制人CMM 細胞的增殖并促進其凋亡，從而為進一步研究Zwilch在人CMM發病中的作用及機制、以及后續以Zwilch為靶點進行人皮膚黑素瘤靶向治療提供了實驗依據。