植物葉綠素代謝途徑及其分子調控

李 根，張 成，王 強，王 科，劉思汐，楊 勛，吳繼開，卿秋靜

(成都市農業技術推廣總站，四川 成都 610041)

1 葉綠素代謝途徑的研究進展

葉綠素(chlorophyll)是一類與植物光合作用有關的最重要的色素。高等植物葉綠素主要為葉綠素a和葉綠素b，兩者的差異在于吡咯環Ⅱ的附加基團上，葉綠素a為甲基(-CH3)，葉綠素b為甲醛基(-CHO)。結構的差異導致兩者的顏色存在明顯的差異，葉綠素a呈藍綠色，葉綠素b呈黃緑色。葉綠素吸收大部分的紅光和紫光但反射綠光，所以葉綠素呈現綠色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。葉綠素分子核心部分為卟啉環(Porphyrin ring)，具有光能吸收的功能；而側鏈部分為較長的脂肪烴(葉綠醇，Phytol)，是葉綠素插入到類囊體膜上的支點。

葉綠素的生物合成及降解途徑較為復雜(如圖1所示)，合成途徑包括15步酶促反應，其中涉及的酶由27個相關基因編碼；降解途徑分為兩步，第一步在葉綠體中進行，有4種酶參與，葉綠素被降解為無色的、藍色熒光中間產物pFCC，第二步是經過修飾的pFCC在液泡中發生非酶學異構最終形成非熒光葉綠素代謝產物NCCs。

降解途徑的研究進程重要的轉折點是1991年Kr?utler等發現了大麥中非熒光葉綠素代謝物(Hv-NCC-1)。NCCs被解析之后，研究人員以脫鎂葉綠酸a為底物，進行體外轉化，相繼鑒定了紅色葉綠素代謝物(RCC)及其還原產物即初級熒光葉綠素代謝物(pFCC)。葉綠素降解過程早期發生在葉綠體中，但其代謝“終”產物非熒光葉綠素代謝產物(NCC)存儲在液泡中。葉綠素b能在葉綠素b還原酶作用下還原生成葉綠素a。據截止目前的報道，Chl a在去鎂離子去植基生成脫鎂葉綠酸a(Pheide a)的過程中存在2條不同途徑：一條途徑是Chl a在葉綠素酶(CLH)和脫鎂螯合酶(MCS)作用下脫去植基與鎂離子，最后生成Pheide a；另一種途徑則是以脫鎂葉綠素為中間產物，在脫植基之前在MCS作用下先除去鎂離子，生成的Phein a則在脫鎂葉綠素酶(PPH)作用下除去植基，最后也生成Pheide a。然而，第一條降解途徑早已受到質疑。有研究表明，擬南芥編碼Chlase基因突變體仍能在衰老過程中降解葉綠素，表明了葉綠素酶并不是葉綠素早期代謝過程中必需的酶。PPH已被證實對Phein a有專一性，是真正負責葉綠素脫植基的水解酶。因此，認為葉綠素早期代謝過程以第2條代謝途徑存在較為合理(如圖1所示)。葉綠素脫植基脫鎂離了后生成的Pheide a在脫鎂葉綠酸a加氧酶(PA0)和紅色葉綠素代謝產物還原酶(RCCR)作用下，最后生成初生熒光葉綠素代謝產物(pFCC)，其中間產物為紅色葉綠素代謝產物(RCC)。

圖1 高等植物葉綠素代謝途徑

2 葉綠素合成及降解途徑關鍵酶

在葉綠素代謝途經中，近年來隨著物質代謝分析手段、生物信息學等的發展進步，新的觀點不斷涌現，從單純的代謝途徑，逐步深入到調控機制。其中報道較多的關鍵酶包括7種。

2.1 葉綠素合成途徑關鍵酶及其調控

2.1.1 原脫植基葉綠素還原酶(POR) 原脫植基葉綠素在光照和NADPH存在下，由NADPH原脫植基葉綠素還原酶(POR)催化形成脫植基葉綠素a是葉綠素生物合成途徑和葉綠體發育過程最關鍵的需光過程。在生物體中，催化原脫植基葉綠素還原形成脫植基葉綠素a的酶可分為2種：不依賴光的NADPH原脫植基葉綠素還原酶(DPOR)和依賴光的NADPH原脫植基葉綠素還原酶(POR)。無氧光合細菌只有DPOR酶，光合細菌、藍細菌、藻類和裸子植物具有兩種POR酶，而被子植物只有POR酶。因此，無論黑暗或光照條件，光合細菌、藍細菌、藻類和裸子植物都能合成chl；而被子植物幼苗在黑暗條件下則會發育形成黃化苗。

目前，已經從大麥、擬南芥等植物中分離到3種POR基因：PROA、PORB、PORC。PORA和PORB普遍存在，在黃化幼苗中形成。同時CAOPORACAO作為植物黃化幼苗質體中的主要蛋白酶，是光誘導葉綠體發育起始時期唯一具有活性的POR。與PORA不同的是，PORBCAOmRNA則是隨著光照時間的延長，其含量也逐漸升高。PORC是最后一個被鑒定出的POR基因，它主要在植物迅速積累chl時期到質體發育成熟的過程中起著重要作用。在黃化幼苗中，其mRNA水平很難檢測到，但是在光照之后卻有顯著的增加。

2.1.2 脫植基葉綠素a加氧酶(CAO) 脫植基葉綠素a加氧酶(CAO)作為一種Rieske型單加氧酶，能專一識別脫植基葉綠素a，通過兩步氧化反應將其C7側鏈上的甲基(-CH3)氧化成甲酰基(-CHO)，形成脫植基葉綠素b。然后脫植基葉綠素b由葉綠素合酶(CS)催化在D環加上一個植醇尾巴，形成葉綠素b。因此，CAO在葉綠素b的生物合成過程具有極其重要的作用。CAO基因編碼脫植基葉綠素a加氧酶，最早從萊茵衣藻中分離出來。隨后在藻類、擬南芥和水稻中也相繼得到了分離和鑒定。此外，高等植物CAO的氨基酸序列一般含有4個功能結構域，從N末端開始依次為導膚序列、A domain、B domain和C domain，而原核生物并沒有A domain和B domain。C domain包含一個Rieske簇和一個鐵結合基元，該結構域具有催化活性，能催化脫植基葉綠素a轉化為脫植基葉綠素b。將缺失A domain的CAO基因轉入擬南芥后，轉基因植株中的CAO蛋白含量顯著下降，同時葉片中葉綠素a/b的比值也減小；相似地，使僅含有C domain的藻類CAO基因在擬南芥中過表達后，葉綠素a/b的比值也顯著減小。由此說明，A domain參與調節CAO蛋白的表達。然而這種調節機制并不存在于葉綠素b合成缺陷突變體中，其CAO蛋白的表達水平受葉綠素b含量的調節。目前關于domain B的生物學功能仍是不太清楚，僅從B domain中鑒定出了一個基元結構-PEST motif，從結構上看其屬于親水性氨基酸序列。它的功能主要是充當A domain和C domain的鏈接者，起到穩定CAO蛋白的作用，并不能參與調節CAO蛋白的表達。

2.1.3 鎂離子螯合酶(CHL) 鎂原卟啉IX合成始于原卟啉IX，隨后經多步酶促反應最終形成葉綠素。催化該途徑的酶是鎂離子螯合酶(CHL)。鎂離子螯合酶是一個ATP依賴的異源聚合酶，由I、D和H3個亞基組成。研究者們利用鎂離子螯合酶3個亞基的重組蛋白進一步研究發現，鎂離子螯合酶激活步驟需要I亞基、D亞基、ATP以及鎂離子的共同參與；而在鎂離子螯合步驟中，H亞基被認為是鎂離子螯合酶的催化亞基，能結合底物原卟啉IX，結合了底物原卟啉IX的H亞基與ATP-I-D-Mg2+復合物結合后，D亞基發生變構，I亞基的ATP酶活性被激活從而水解ATP為鎂離子螯合提供能量；此時，形成的鎂離子螯合酶全酶將鎂離子螯合到原卟啉IX中形成鎂原卟啉IX，完成整個催化過程。目前研究表明，參與調控鎂離子螯合酶活性的因素包括光照和晝夜節律、葉綠體氧化還原狀態及鎂離子螯合酶各亞基之間的相互作用等(圖2)[1]。

圖2 植物鎂離子鰲合酶活性調控及參與的信號通路[1]

光照和晝夜節律能調控鎂離子螯合酶各亞基CHLI、CHLD和CHLH基因表達。在去白化過程中，高等植物鎂離子螯合酶各亞基受光照誘導后表達量明顯上調。此外，晝夜節律對植物鎂離子螯合酶各亞基的表達具有調控作用，且呈現不同的調控模式。在去白化過程中，光照是鎂離子螯合酶基因表達的重要調控因素；而晝夜節律同樣是鎂離子螯合酶基因轉錄的調節因素。這暗示著鎂離子螯合酶基因轉錄水平上的調控是鎂離子螯合酶活性調控的關鍵點。在黑暗下，葉綠體中處于氧化狀態，TRX-F和TRX-M等葉綠體氧化還原調控蛋白氧化鎂離子螯合酶，鎂離子螯合酶失去催化活性。在光照下，葉綠體中處于還原狀態，I亞基半胱氨酸巰基被葉綠體氧化還原調控蛋白還原，鎂離子螯合酶恢復活性，催化葉綠素合成。

2.2 葉綠素降解途徑關鍵酶及其調控

2.2.1 葉綠素酶(CLH) 葉綠素酶(CLH)是葉綠素分解代謝第一條途徑的起始酶，Harpaz-Saad等[2]對柑橘(Citrussinensis)CLH的異源表達研究表明，CLH是一個葉綠素分解代謝的限速酶。細胞通過剪切多肽 N端與Glu脫羧酶結合的調控結構域，或者負責膜結合的結構域而進行轉錄后調控。目前，通過體外研究已經對葉綠素酶的催化特性，如動力學參數、pH值與溫度的影響等有了比較詳細地了解。葉綠素酶的測活體系與一般的酶有所不同。在有機溶劑或去垢劑存在時，葉綠素酶在室溫時即可表現活性，而在以水為微環境的反應體系中，其表現活性的溫度較高(65～75℃ )。葉綠素酶在微堿性(pH值7.5～8.0)環境中催化活性高，橄欖的葉綠素酶的最適pH值是8.5，而柑橘葉片葉綠素酶的最適pH 為7.8。盡管有學者指出CLH在葉綠素降解過程中無足輕重[3]，但是仍有不少研究證明CLH在葉綠素降解過程中起到了毋庸置疑的作用。與葉綠素酶生理研究相比，在分子水平上研究葉綠素酶還比較少，在葉綠素酶基因克隆或轉錄水平的表達的研究不多，在葉綠素酶的研究中還存在著許多棘手問題。

2.2.2 脫鎂鰲合酶(MCS) 脫鎂鰲合酶(MCS)催化葉綠素a脫去鰲合的鎂原子形成脫鎂基葉綠素a。迄今為止，該酶是唯一發現具有催化葉綠素a轉化為脫鎂基葉綠素a功能的酶。通過比較衰老與未衰老葉綠體中的活性，發現此酶與葉綠素酶一樣，也屬于組成性表達的酶，但與葉綠素酶不同的是，在衰老葉片中保持MCS的活性需要不斷地有新的蛋白質合成。脫鎂鰲合酶(MCS)具有熱穩定性，且在不同植物中分子量較低且不一致。Shioi等[4]從藜葉片中發現了一種耐熱的、具有MCS活性的小分子物質。Matile等[5]認為，此種小分子物質可能就是MCS的輔基。值得一提的是，催化反應的產物脫鎂基葉綠酸a是一種可見光的敏感物質，此物質可以在無氧條件下對質粒進行光裂解。

2.2.3 脫鎂葉綠素酶(PPH) 脫鎂葉綠素酶(PPH)是葉綠素降解代謝的關鍵酶，在葉綠素降解過程中PPH是卟啉—植醇水解過程參與的候選酶，對脫鎂葉綠素很活躍，但對葉綠素卻沒有作用。PPH酶的作用是將脫鎂葉綠素a轉換為脫鎂葉綠酸a。在葉片衰老過程中PPH基因的表達加強，加快脫鎂葉綠素a轉換為脫鎂葉綠酸a，加速葉片衰老。PPH酶的缺失能夠造成植物滯綠表現型，是一種非功能的滯綠，葉綠素代謝在一定程度上受損，葉綠素緩慢降解，葉片保綠時問較長，衰老被延遲。

2.2.4 脫鎂葉綠酸a加氧酶(PAO)SID基因是編碼PAO(脫鎂葉綠酸a加氧酶)的基因，負責控制葉綠素大卟啉環的降解，而該基因具有加速細胞死亡的功能。PAO能將脫鎂基葉綠酸a(Pheide a)降解為不穩定的紅色葉綠素代謝產物(RCC)后最終形成無色的初生熒光葉綠素代謝產物(pFCC)，是葉綠素降解途徑中脫綠代謝的關鍵步驟。PAO酶作用于葉綠素降解的方式較靈活，如持綠蛋白SGR可通過影響PAO酶的活性使植物表現為滯綠或黃化。PAO編碼基因缺失會產生滯綠突變體，而PAO基因的表達與衰老密切相關。在植株衰老和傷害時PAO基因表達水平上調，在葉片衰老后期，PAO活性達到最高；在衰老的葉片中，抑制PAO的活性，將導致脫鎂葉綠酸a的積累和葉綠素降解的抑制；在滯綠突變體的葉片衰老過程中PAO活性非常低。因此通常認為編碼該酶的基因突變是滯綠突變體保持綠色的原因之一。

SGR/SGRL基因的鑒別是近年來葉綠素降解調控研究中的一個里程碑。高等植物的滯綠基因SGR家族主要存在2種進化分支，包括SGR亞家族和SGRL亞家族。2個亞家族的成員在單子葉及雙子葉植物中均存在，但在雙子葉植物和單子葉植物類群中，SGR/SGRL亞家族所包括的同源基因數目不同。雙子葉植物擬南芥中已發現3個SGR同源基因， 分別為SGR1(At4g22920)、SGR2(At4g11910)和SGRL(At1g44000)。滯綠基因SGR的功能與葉綠素降解調控有關，它可能通過激發NYC、PPH 、PAO、RCCR等多個葉綠素降解酶與捕光復合物II(LHCII)相互作用，形成SGR-CCE-LH-CII復合體，促使葉綠素分子從LHCII上解離，并構成一個有助于葉綠素快速降解的“代謝通道”。SGR1和SGR2還可以形成同源或異源二聚體，SGRL也可以與SGR1、SGR2形成同源或異源二聚體，這種二聚體結構可能在一定程度上能夠調節SGRL基因的活性。SGR2基因在葉綠素降解過程中與SGR1起拮抗作用，可能是SGR1和SGR2形成異源二聚體時， 削弱了SGR1與CCEs互作的能力。SGR基因在擬南芥葉片衰老中的功能如圖3所示。

圖3 SGR基因在擬南芥葉片衰老中的功能

除了持綠蛋白SGR，一些激活因子(如ATAF1)同樣可以上調PAO的表達來調節葉綠素的降解。Ghandchi等[6]通過對幾組擬南芥基因組和生物信息學實驗進行重新分析發現植物ATAF1等轉錄因子在溫暖條件、葉片衰老、干旱等條件脅迫下會因觸發植物應對這些逆境的響應進而通過上調PAO表達調控葉綠素降解。這些轉錄因子形成一個調控網絡，共同行使其調控功能，影響植物葉綠素的降解(如圖4所示)。

圖4 葉綠素降解調控關系

3 葉綠素代謝途徑關鍵基因

葉綠素代謝途徑關鍵酶及其編碼基因詳見表1。

表1 葉綠素代謝關鍵酶及其編碼基因

4 展望

目前，葉綠素生物合成及降解途徑已較為清晰，其中關鍵酶及編碼基因已有許多報道，但仍然存在許多問題仍未解決，比如有研究首次發現在成熟香蕉皮中檢測到被高度修飾的熒光葉綠素代謝物( hFCCs)[7]，緊接著在香蕉葉和白鶴芋葉中也發現了hFCCs[8]，這就意味著在pFCC之后可能存在其他中間產物，或者在pFCC之后葉綠素降解途徑可能開始有了新的分支，那么，就植物體在不同條件下的葉綠素代謝而言，是否伴隨有其他途徑，有待進一步證實；其次，涉及基因的功能和作用機理也尚未完全清晰，近年來涉及葉綠素代謝關鍵基因的研究主要集中在一些突變體中，對于功能驗證方面報道較少；最后，對于葉綠素降解調控的研究，多集中于SGR和LHCP II-葉綠素復合體，有關調控的分子信號，降解產物與關鍵酶之間的相互作用等尚不清楚，值得深入探究。