柚木心材和邊材的LC-MS代謝組學比較

劉李花，劉云，尹加筆，哏玉響寶，李北屏，韓會俊，趙平*

(1. 西南林業(yè)大學西南地區(qū)林業(yè)生物質資源高效利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室, 昆明 650233；2. 德宏州林業(yè)和草原局, 云南 芒市 678400; 3. 瑞麗市林業(yè)和草原局, 云南 畹町 678500)

大多數(shù)樹木均有心材和邊材之分，心材是樹木中靠近樹心顏色較深的部分，其耐腐性較強，在樹木的生長過程中起支撐作用，同時也是體現(xiàn)樹木質量和價值的主體[1]。木材的形成源自樹木維管形成層的細胞分裂活動，伴隨著細胞壁初級代謝和次生代謝各化學組分的生物合成及其空間結構的自我組裝[2-3]。木材的顏色作為木材銷售過程中的一個重要商品屬性，其顏色的形成主要與木材中黃酮類、酚類等呈色次生代謝產(chǎn)物的合成和積累有關，并受遺傳背景、樹齡、環(huán)境等多種因素的影響[4-6]。因此，闡明木材形成中代謝物的種類、分布規(guī)律及其代謝途徑，有助于揭示木材的細胞壁構建及其呈色機制，并為木材的材性改良提供理論基礎。

柚木(Tectonagrandis)為馬鞭草科柚木屬的落葉、半落葉喬木樹種，是季節(jié)性熱帶地區(qū)種植較廣泛的一種珍貴木材樹種，目前種植面積大約600萬hm2。因其天然的耐久性、良好的尺寸穩(wěn)定性和表面裝飾性等特性，柚木已被許多熱帶國家列入木材生產(chǎn)再造林計劃，并廣泛應用于游艇、家具和建筑材料等制造行業(yè)[7]。柚木心材和邊材的顏色區(qū)別明顯，具有從邊材到心材的明顯顏色過渡。連彩萍等[8]研究了柚木光變色規(guī)律及機理，發(fā)現(xiàn)引起柚木光變色的因素主要為木素的降解及提取物中不飽和鍵斷裂生成的發(fā)色基團。Moya等[7,9]發(fā)現(xiàn)樹齡、產(chǎn)地、環(huán)境條件和營林技術等因素可能會影響柚木心材抽提物含量和顏色的變化。Qiu等[10]推測酚類、醌類和酮類等次生代謝物可能是引起柚木邊心材顏色差異明顯的主要原因。邱竑韞等[11]研究了柚木石油醚抽提物成分及其對心邊材顏色的影響，但導致邊心材之間顏色差異的原因至今不明。代謝組學是以組群指標分析為基礎，以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模與系統(tǒng)整合為目標的系統(tǒng)生物學的一個重要分支，能夠提供無創(chuàng)、快速、準確和高通量的分析，近年來被廣泛應用于植物學、林學、農(nóng)學、營養(yǎng)學、藥理學等諸多研究領域中[12-13]。

筆者以柚木心材和邊材為研究對象，采用液質聯(lián)用(LC-MS)代謝組學技術對柚木次生代謝物進行系統(tǒng)分析，闡明心材和邊材的差異代謝物，探討這些代謝物的代謝途徑，以期為進一步揭示柚木心材顏色形成機理等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

柚木樣品于2019年8月取自云南省德宏州盈江縣國有林場(97°31′E，24°24′N)，隨機選取1995年種植的6株胸徑基本一致的柚木樹，用生長錐在量取胸徑處分別取心材和邊材樣本各1 g于5 mL凍存管后置入液氮中保存?zhèn)溆谩代表邊材，6份邊材樣本編號為C1～C6；F代表心材，6份心材樣本編號為F1～F6。

LC-MS使用的甲醇、乙腈、甲酸、2-丙醇和超純水，購自美國Fisher Chemical公司。

1.2 主要儀器與設備

New Classic MF MS105DU型電子天平，德國Mettler Toledo公司；Centrifuge 5424 R型和5430 R型冷凍離心機，德國Eppendorf公司；SBL-10DT型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Wonbo-96c型高通量組織破碎儀，上海萬柏生物科技有限公司；LNG-T88型臺式快速離心濃縮干燥器，太倉市華美生化儀器廠；JXDC-20型氮氣吹掃儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；ExionLC AD System型液相色譜系統(tǒng)和ABSCIEX-Triple TOF 5600型質譜儀，美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

精確稱取 50 mg柚木各樣品加入2 mL加厚離心管中，加入直徑6 mm鋼珠一枚，在離心管中依次加入0.3 mg/mL用L-2-氯-苯丙氨酸和乙腈配制的內(nèi)標溶液20 μL、V(甲醇)∶V(水)=4∶1提取液400 μL，在-20 ℃低溫下用高通量組織破碎儀在50 Hz條件下破碎6 min，之后在5 ℃下渦旋30 s使樣品混勻，在40 kHz下超聲萃取 30 min。將樣品于-20 ℃條件下靜置30 min沉淀蛋白質后，在4 ℃、13 000×g條件下離心15 min，取上清液并抽干；再用V(乙腈)∶V(水)=1∶3的溶液100 μL復溶后進行上機分析。心邊材各6個重復，同時本次所有檢測樣品的混合樣本作為質控樣本(QC)，用于判斷分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1.3.2 LC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為美國Waters 公司的BEH C18柱(長×直徑為100 mm×2.1 mm, 填充料直徑1.7 μm)，流動相A為含質量分數(shù)0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含質量分數(shù)0.1%甲酸的乙腈/異丙醇(體積比1∶1)溶液，流速為0.40 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為40 ℃。流動相梯度洗脫的條件為：體積分數(shù)5%～20%B(0～3.0 min)，20%～95%B(3.0～9.0 min)，95%B(9.0～13.0 min)，95%～5%B(13.0～13.1 min)，5% B(13.1～16.0 min)。

質譜條件：質量掃描范圍50～1 000 m/z，噴霧氣0.34 MPa，輔助加熱氣0.34 MPa，氣簾氣0.20 MPa，離子源加熱溫度500 ℃，離子化正極電壓5 000 V，離子化負極電壓4 000 V，去簇電壓80 V，碰撞能的起伏電壓20～60 V。

1.3.3 代謝物鑒定

經(jīng)超高效液相色譜聯(lián)用質譜(UPLC-Triple-TOF-MS)分析后，原始數(shù)據(jù)導入代謝組學處理軟件Progenesis QI(美國Waters 公司)進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊，最終得到一個保留時間、質荷比和峰強度的數(shù)據(jù)矩陣。然后進行數(shù)據(jù)預處理，主要包括：保留至少一組樣品中非零值80%以上的變量；對原始數(shù)據(jù)進行缺失值填充；對總峰進行歸一化處理，并刪除QC 樣本相對標準偏差(RSD)≥30%的變量；對數(shù)據(jù)進行l(wèi)og轉換得到最終用于后續(xù)分析的數(shù)據(jù)矩陣。利用精確的質譜、質譜片段譜和同位素比值差在人體代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB)和串聯(lián)代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(METLIN)等數(shù)據(jù)庫中進行搜索鑒定。

1.3.4 差異代謝物通路分析

將差異代謝物映射到京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)，獲得差異代謝物的代謝途徑和富集情況。

1.3.5 統(tǒng)計分析

采用主成分分析方法(PCA)觀察各樣品之間的總體分布和組間的離散程度，采用正交-偏最小二乘法分析(OPLS-DA)以區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，篩選組間的差異代謝物。

2 結果與分析

2.1 心邊材代謝物的鑒定

12個柚木樣品數(shù)據(jù)經(jīng)LC-MS數(shù)據(jù)分析軟件分析處理，并在HMDB和METLIN等數(shù)據(jù)庫中進行搜庫，在正負兩個離子模式下，共定性得到705個代謝物。其中，代謝物中包括脂類和類脂180個、含氧有機物120個、苯丙素和聚酮類101個、有機雜環(huán)化合物82個、有機酸及其衍生物58個、苯環(huán)衍生物49個、核苷/核苷酸和類似物14個、含氮有機物5個、木脂素/新木脂素及相關化合物4個、生物堿及其衍生物3個、含鹵素有機物1個和其他化合物88個(表1)。從表1中可以看出，脂類和類脂分子的占比最高(25.53%)，其次為含氧有機物(17.02%)、苯丙素和聚酮類(14.33%)。

表1 基于HMDB的柚木代謝物分類Table 1 Classification of teak metabolites by HMDB

進一步分析發(fā)現(xiàn)，柚木邊材中含量在前10位的代謝物為4-羥基-5-(3′,4′-二羥基苯基)-戊酸-O-甲基-O-葡萄糖醛酸苷(圖1)、磷脂酰乙醇胺(PE)[15∶0/18∶3 (6Z, 9Z, 12Z)]、螺內(nèi)酯D、奎寧酸、油酰胺、PE[(14∶1 (9Z)/18∶3 (9Z, 12Z, 15Z)]、亞油酰胺、積雪草皂苷B、西番蓮苷VI和葡糖鞘氨醇；心材中含量在前10位的代謝物為kanokoside A(圖1)、PE[15∶0/18∶3(6Z, 9Z, 12Z)]、銀杏內(nèi)酯C、螺內(nèi)酯D、奎尼酸、西番蓮苷VI、PE[14∶1 (9Z)/18∶3 (9Z, 12Z, 15Z)]、葡糖鞘氨醇、紫膠烯C和6-(2-羧乙基)-7-羥基-2,2-二甲基-4-苯并二氫吡喃酮葡萄糖苷。

圖1 4-羥基-5-(3′,4′-二羥基苯基)-戊酸-O-甲基-O-葡萄糖醛酸苷(a)和kanokoside A (b)的化學結構Fig. 1 Chemical structures of 4-hydroxy-5-(3′,4′-dihydroxyphenyl)-valeric acid-O-methyl-O-glucuronide (a) and kanokoside A (b)

2.2 心邊材代謝物的相關性分析

依據(jù)代謝物在不同樣本間的表達情況，對樣本進行PCA和相關性熱圖分析，結果見圖2，可判斷組內(nèi)樣本的相似性和組間樣本的差異性。圖2a 中每個格子表示兩個樣本之間的相關性，不同顏色代表樣本間相關系數(shù)的相對大小，聚類樹枝的長度表示樣本間相對距離的遠近，同一枝上的樣本相似性更接近。由圖2a可以看出，柚木心材與邊材之間的相關性較小，而心材與心材之間、邊材與邊材之間的相關性較大。由樣本PCA得分(圖2b)可以看出，QC樣本聚在一起，說明樣本間的重復性良好，在分析過程中分析系統(tǒng)穩(wěn)定，所得的實驗數(shù)據(jù)可信度高。主成分1和主成分2對模型的累積差異解釋率為0.568(>0.5)，說明PCA模型效果較好。此外，心材和邊材的樣本點均在置信橢圓內(nèi)，說明組間重復性較好，邊材和心材的置信橢圓離得較遠，說明柚木邊材和心材代謝物存在顯著差異。從整體上看PCA得分圖，心材之間的聚集性大于邊材之間的聚集性，說明心材樣本中所含代謝物的組成和濃度比邊材樣本更為接近。

圖2 柚木代謝物的相關性熱圖和PCA得分圖Fig. 2 Correlation heat map and PCA score plot of T. grandis metabolites

2.3 心邊材代謝物的正交-偏最小二乘法分析

表2 OPLS-DA模型參數(shù)Table 2 OPLS-DA parameters

R2=(0,0.7247), Q2=(0,-0.1536)。圖3 OPLS-DA置換檢測Fig. 3 OPLS-DA permutation test

2.4 心邊材顯著性差異代謝物的分析

柚木心邊材顯著性差異代謝物的分析結果見聚類熱圖(圖4a)和火山圖(圖4b)。圖4a中每列表示一個樣本，每行表示一個代謝物，圖中的顏色表示代謝物在該組樣本中相對表達量的大小。圖左側為代謝物的樹狀聚類，右側為代謝物名稱，兩個代謝物分支離得越近，說明它們的表達量越接近；圖上方為樣本的樹狀聚類，下方為樣本名稱，兩個樣本分支離得越近，說明這兩個樣本代謝物的表達量變化趨勢越接近。從圖4a可以看出，同一化合物在心材之間、邊材之間的表達量差異較小，而心材與邊材之間的表達量差異較大，說明柚木心材和邊材之間代謝物存在顯著差異。

圖4 柚木心邊材差異代謝物的聚類熱圖和火山圖Fig. 4 Cluster heat map and volcano map of different metabolites in the heartwood and sapwood of T. grandis

圖4b中，紅色點代表顯著升高的代謝物，綠色點代表顯著下降的代謝物，灰色點代表差異不顯著的代謝物。經(jīng)篩選鑒定發(fā)現(xiàn)供試柚木心材和邊材中共分析出9 211個峰(定性到705個代謝物)，其中差異峰有3 396個。從差異峰中共定性到328個顯著差異的代謝物，包括脂質和類脂質分子69個、苯丙素和聚酮類57個、含氧有機物50個、有機雜環(huán)化合物41個、有機酸及其衍生物24個、苯環(huán)衍生物23個、核苷/核苷酸和類似物8個、含氮有機物2個、生物堿及其衍生物2個、木脂素/新木脂素及相關化合物1個和其他化合物51個。在這些顯著差異代謝物中，與邊材相比，有235個代謝物在心材中顯著升高，上調代謝物占總代謝物的71.65%，有93個代謝物在心材中顯著降低，下調代謝物占總代謝物的28.35%，進一步表明心材和邊材代謝物存在明顯差異。

2.5 心邊材差異代謝物代謝途徑和富集分析

柚木心材和邊材差異代謝物的KEGG代謝通路和富集分析結果見圖5。柚木心邊材的差異代謝物被注釋到代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理等3個一級通路，28個差異代謝物被注釋到膜運輸、轉運、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、脂質代謝、輔助因子和維生素代謝、其他氨基酸代謝、萜類和聚酮化合物代謝、核苷酸代謝和其他次生代謝產(chǎn)物生物合成等11條二級代謝通路(圖5a)。對被注釋到的差異代謝物進行分析，發(fā)現(xiàn)在心材中上調的代謝物有13個。圖5b顯示了重要性得分前20的通路，其中半乳糖代謝、氨基糖及核苷酸糖代謝分別富集了4個代謝物，戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化通路、精氨酸生物合成以及玉米素生物合成均富集了3個代謝物，D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝、組氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、異黃酮生物合成以及色氨酸代謝各富集了2個代謝物，碳青霉烯生物合成、花青素生物合成、生物素代謝、甘油酯代謝、賴氨酸生物合成、抗壞血酸和醛酸代謝、糖酵解/糖異生以及牛磺酸和低鈣氨酸代謝各富集了1個代謝物。總體看來，柚木心邊材差異代謝物參與氨基酸的合成較多。值得注意的是，黃酮類生物合成共富集了3個代謝物，其中異黃酮生物合成富集了2個代謝物，花青素生物合成富集了1個，心邊材差異代謝物被富集到黃酮類化合物的生物合成中可能是造成柚木心材和邊材顏色明顯差異的原因之一。

圖5 心材和邊材差異代謝物的KEGG代謝通路和富集圖Fig. 5 KEGG metabolic pathway and enrichment of different metabolites in heartwood and sapwood

2.6 心邊材顯著差異代謝物中相對含量前30代謝物的鑒定分析

木材形成是一個系統(tǒng)的代謝反應過程，伴隨大量的前驅物、中間體、酶類等的共同參與。因此，闡明木材形成中的代謝物種類、分布規(guī)律及其代謝途徑，將有助于揭示木材細胞壁的構建機制和木材呈色機制。木材抽提物中包含結構類型多樣的不飽和和共軛的酚類結構(如黃酮類、醌類、苯丙素類等)，在木材著色過程中發(fā)揮著重要的作用[15-16]。在心邊材328個顯著差異代謝物中篩選出相對含量前30的代謝物，按樣本之間代謝物濃度的差異倍數(shù)(FC值)降序排列如表3所示。30個代謝物在心材中均受到上調，其中8-乙酰基埃格爾內(nèi)酯、(all-E)-3,5,7-Tridecatriene-9,11-diyn-1-ol、谷胱甘肽異磺酰離子、1,2-脫水白色向日葵素和Yucalexin P-15等5個代謝物含有不飽和結構，其余25個代謝物均為含有共軛體系的芳香雜環(huán)或酚(苷)類衍生物，推測這些代謝物可能是造成心邊材色差明顯的主要原因之一。

表3 心邊材顯著差異代謝物中相對含量前30的代謝物Table 3 The top 30 significant different metabolites in heartwood and sapwood

3 結 論

本研究首次采用UPLC-Triple-TOF-MS分析手段，結合PCA和OPLS-DA等統(tǒng)計分析方法，對1995年栽種于云南省德宏州盈江縣國有林場6株柚木樹心邊材中的次生代謝產(chǎn)物進行了分析比較。主要結論如下：

1)12個柚木樣品數(shù)據(jù)經(jīng)LC-MS數(shù)據(jù)分析軟件分析處理，并在HMDB和METLIN等數(shù)據(jù)庫中進行搜庫，在正負兩個離子模式下，共定性得到705個代謝物；其中脂類和類脂類分子最為豐富。

2)心邊材中相對含量最高的代謝物分別為環(huán)烯醚萜苷kanokoside A和4-羥基-5-(3′,4′-二羥基苯基)-戊酸-O-甲基-O-葡萄糖醛酸苷。

3)柚木心材和邊材的代謝物存在顯著差異，從心邊材中共鑒定出差異代謝物328個，與邊材相比，心材中共有235個代謝物上調，93個代謝物下調。進一步分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)差異代謝物被富集到各類氨基酸代謝和黃酮類生物合成等代謝通路中。

4)心邊材中相對含量前30的顯著差異代謝物在心材中均得到上調，且均含有不飽和結構和共軛結構，推測這些代謝物可能與柚木心邊材顏色明顯差異有關。