抑菌放線菌篩選鑒定及其發(fā)酵條件和發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性的研究

晏愛芬 余 麗 司紅艷 韋胡偵

（保山學院 資源環(huán)境學院，云南 保山 678000）

抗生素(antibiotics)是由各種微生物或高等動植物在其生命活動過程中所產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物[1]，具有抗病原體或干擾其他生活細胞發(fā)育功能的作用。其中大家最為熟知的就有鏈霉素(Streptomycin)、殺稻瘟菌素（Blasticidin）、多抗霉素（Polyoxin）和井岡霉素（Validamycin）等。鏈霉素是從一種灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)的發(fā)酵液中提取的抗菌素，對植物細菌病害的防治效果較好，被廣泛用來防治蔬菜、花卉和果樹栽培的病害[2]；殺稻瘟菌素[3]是一種肽基核苷抗生素，由灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)代謝產(chǎn)生，主要通過干擾細胞核糖體中肽鍵的形成來抑制蛋白質(zhì)的生物合成，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被大量應(yīng)用于水稻稻熱病的防治；多抗霉素[4]是由金色鏈霉菌（Streptomyces aureus）代謝所產(chǎn)生的抗生素，屬于廣譜性殺菌劑；井岡霉素[5]是由吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）代謝所產(chǎn)生的抗真菌劑，能夠防治水稻病原真菌水稻紋枯病菌（Rhi?zoctonia solani）感染所引起的紋枯病害。

放線菌是與人類生產(chǎn)和生活關(guān)系密不可分的一類革蘭氏陽性細菌，當前使用的抗生素約占70%由各類放線菌產(chǎn)生而來。除抗生素外，部分放線菌還能代謝產(chǎn)生各種酶制劑[6]、維生素和有機酸等。海洋、湖泊、土壤、動植物體內(nèi)，甚至極端環(huán)境中都能找到放線菌的蹤跡，其中土壤中的放線菌含量最高、種類最多。劉曉飛等[7]從黑龍江黑土中分離篩選到產(chǎn)藍色素的放線菌，能抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長；李菲等[8]從廣西茅尾海紅樹林自然保護區(qū)土壤中共分離到444株放線菌，篩選出具有功能酶活性的菌株56株。高黎貢山豐富多樣的地貌類型為放線菌的篩選提供了更多的便利。本研究從高黎貢山國家級自然保護區(qū)百花嶺采集土壤，采用富集培養(yǎng)和劃線分離法，分離土壤放線菌，并以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌作為指示菌來篩選具有抑菌活性的放線菌。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品

采自高黎貢山國家級自然保護區(qū)百花嶺。

1.1.2 培養(yǎng)基

高氏1號培養(yǎng)基的配制參考李麗等(2018)[9]的研究方法；

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制參考戴航宇等(2020)[10]的研究方法。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤放線菌的篩選

將采集到的土壤濕土或風干樣品稱取5 g，加入到45 mL無菌水的三角瓶中，充分震蕩并進行沉淀，吸取上清液用無菌水稀釋成10?2～10?3的菌懸液，取0.1 mL在高氏1號培養(yǎng)基平板表面涂布均勻，28℃培養(yǎng)1 w。

用接種針挑取培養(yǎng)好的放線菌單菌落于高氏一號培養(yǎng)基上，用平板劃線法[11]進一步分離純化，培養(yǎng)6 d～7 d后形成單菌落，挑取單菌落于斜面培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)1 w左右，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌放線菌的篩選

用接種針分別將分離純化好的放線菌依次接種到裝有100 mL高氏1號液體培養(yǎng)基的三角瓶中（已滅菌），置于28℃、轉(zhuǎn)速為195 rpm的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)液用0.22 μm濾膜過濾，濾液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，由保山學院微生物試驗室提供）置于37℃、200 rpm，恒溫培養(yǎng)12～24 h。再用移液槍各吸取0.1 mL菌液，均勻涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，待20 min～30 min菌液滲入培養(yǎng)基后，用滅菌的鑷子夾取4張直徑為5 mm的濾紙片，等距離的放在平板上，用無菌移液槍吸取200 μL的放線菌發(fā)酵濾液分別滴在3張濾紙片上，其中一張濾紙片滴加等量的無菌水做對照，做好標記后重復(fù)三次，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h～24 h后觀察和測量抑菌圈直徑，篩選出具有抑菌活性的菌株。

1.2.3 放線菌的初步分類鑒定

1.2.3.1 菌株的培養(yǎng)特征

在高氏一號培養(yǎng)基上接種放線菌，28℃培養(yǎng)1 w，觀察菌落的形態(tài)和生長情況[12]。

1.2.3.2 菌株的顯微特征

將滅菌的蓋玻片以45度角斜插入高氏一號培養(yǎng)基上，再在蓋玻片一側(cè)接種放線菌，28℃培養(yǎng)1周，菌絲生長并附著于蓋玻片上，輕輕拔出蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌絲和孢子的形態(tài)[13]。

1.2.3.3 菌株的生理生化特征

明膠液化試驗：在明膠液化培養(yǎng)基斜面上接種菌種，28℃培養(yǎng)，于接種后第5d、第10d、第15 d將斜面培養(yǎng)基放到4℃，30 min后觀察明膠液化程度，明膠水解陽性為菌落周圍明膠轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w狀態(tài)[14]。

淀粉水解試驗：在淀粉水解培養(yǎng)基（可溶性淀粉5.0 g，NaCl 0.25 g，MgCO30.5 g，KNO30.5 g，KH2PO40.2 g，瓊脂粉10.0 g，蒸餾水500 mL，pH 7.2～7.4）平板上接種菌株，28 ℃培養(yǎng)1周，滴加幾滴碘酒于菌落附近，若淀粉不變藍而是形成了透明圈，則有淀粉酶產(chǎn)生，圈越大說明淀粉酶活性越強[15]。

纖維素水解試驗：把剪好的濾紙條的一端浸沒在纖維素分解培養(yǎng)基試管中，滅菌，在液面以上的濾紙條上接種放線菌，28℃培養(yǎng)1 w，如果菌株產(chǎn)生纖維素酶則能水解濾紙條或者使其折斷或變薄[16]。

牛奶的凝固與胨化試驗：在脫脂牛奶管（牛奶500 mL，CaCO30.1 g）中接種菌株，28℃培養(yǎng)1～2周，凝固為牛奶出現(xiàn)凝塊，胨化為凝固后有液體出現(xiàn)且凝塊進一步水解成液體[17]。

產(chǎn)生硫化氫的試驗：在硫化氫產(chǎn)生培養(yǎng)基中接種放線菌，28℃培養(yǎng)1 w，若有硫化氫產(chǎn)生則培養(yǎng)基會產(chǎn)生黑色素[18]。

1.2.4 發(fā)酵條件對發(fā)酵液抑菌活性的影響

將篩選到的抑菌放線菌采用以下不同發(fā)酵條件進行發(fā)酵，過濾后取發(fā)酵液原液，采用生長速率法測定其對指示菌的抑菌率，篩選抑菌活性最優(yōu)的發(fā)酵條件。重復(fù)三次，取平均值。以未加放線菌菌株的發(fā)酵液作為對照。

1.2.4.1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基的影響

采用4種培養(yǎng)基[12]，各取50 mL裝入250 mL的三角瓶中28℃，280 r/min搖床培養(yǎng)6 d～7 d后取樣，測抑菌率。

1.2.4.2 發(fā)酵時間的影響

在250 mL三角瓶中加入50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，195 rpm，28℃恒溫培養(yǎng)，接種后第3 d、第4 d、第5 d、第6 d、第7 d、第8 d后取樣，測抑菌率。

1.2.4.3 不同溫度的影響

在250 mL三角瓶中加入50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基（pH=7.0），分別于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃振蕩培養(yǎng)1 w[19]，測抑菌率。

1.2.4.4 不同pH的影響

將液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，各取50 mL培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到250 mL三角瓶中，195 rpm，28℃振蕩培養(yǎng)1 w，測抑菌率。

1.2.4.5 不同裝液量的影響

分別在250 mL的三角瓶中加入40mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，于195 rpm，28℃振蕩培養(yǎng)1 w，測抑菌率。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性的研究

將篩選到的抑菌放線菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，過濾后取發(fā)酵液原液分別置于不同溫度，不同pH值和紫外條件下處理后，采用生長速率法，測定其對指示菌的抑菌率。重復(fù)三次，求平均值。以未加放線菌菌株的發(fā)酵液做對照。

1.2.5.1 熱穩(wěn)定性

在1.5 mL離心管中加入1 mL放線菌發(fā)酵液，分別于20℃、40℃、60℃、80℃水浴處理30 min，測抑制率。

1.2.5.2 pH耐受性

將放線菌發(fā)酵液的pH分別調(diào)到3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，然后在4℃的冰箱中靜置24 h后將pH調(diào)回到7.0，取樣測抑菌率。

1.2.5.3 發(fā)酵產(chǎn)物的紫外線耐受性

將菌株發(fā)酵液放置于無菌空平板中，開蓋放置在紫外線[20]下，分別在10，20，30，40，50 min時取樣測抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌的分離及抑菌活性的測定

從采集到的土壤中分離得到放線菌57株。采用濾紙片法對57株放線菌發(fā)酵液進行抑細菌活性的測定，測定結(jié)果顯示有13株放線菌對細菌具有抑菌作用，其中菌株F27對三種指示菌均具有抑菌作用，且抑菌效果最好，抑菌直徑都在16 mm以上，如圖1所示。

圖1 菌株F27抑菌放線菌對不同指示菌產(chǎn)生的抑菌圈

2.2 菌株的初步分類和鑒定

2.2.1 菌株F27的菌落培養(yǎng)特征

由圖2可知，菌株F27的背面呈現(xiàn)淺黃色，正面呈現(xiàn)灰白色，油亮狀，近圓形，形狀較規(guī)則，菌落較厚，表面濕潤，菌株邊緣一圈為白色。表面有小孔，凹凸不平。

圖2 菌株F27在高氏一號培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

2.2.2 菌株F27的顯微特征

圖3所示菌株F27在顯微鏡下菌絲呈絲狀分支，直徑較細。孢子絲盤卷形成包囊，生長在氣生菌絲的頂端。

圖3 顯微鏡下菌株F27的菌絲形態(tài)

2.2.3 菌株F27的生理生化特征

對菌株F27進行生理生化特征試驗，其結(jié)果見表1。

表1 菌株F27的生理生化特征

由表1可知，菌株F27能使明膠液化，可使淀粉水解，纖維素水解陰性，可使牛奶凝固和胨化，產(chǎn)黑色素。

由以上菌落形態(tài)特征、顯微特征、生理生化特征分析，根據(jù)放線菌分類系統(tǒng)，可初步確定菌株F27為孢囊鏈霉菌屬（Streptospo?rangium）。孢囊鏈霉菌屬的放線菌具有由氣生菌絲的孢子絲形成的孢囊，它長在氣生菌絲主絲或側(cè)絲的頂部，孢囊內(nèi)部產(chǎn)生多個包囊孢子。由此初步確定菌株F27為孢囊鏈霉菌屬。

2.3 發(fā)酵條件研究

指示菌選用枯草芽孢桿菌。

2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基對發(fā)酵液抑菌活性的影響

采用4種不同配方的培養(yǎng)基對菌株F27進行培養(yǎng)，用生長速率法測定發(fā)酵液的抑制率，其結(jié)果見表2，菌株F27的4種發(fā)酵培養(yǎng)基對枯草芽孢桿菌都有抑制作用，其中最強的是發(fā)酵培養(yǎng)基1，其抑制率達到50%。

表2 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)時間對發(fā)酵液抑菌活性的影響

測定發(fā)酵液在第3、4、5、6、7、8 d對枯草芽孢桿菌的抑制率。其結(jié)果見表3，從第3 d到第6 d，菌株F27發(fā)酵液的抑菌活性在逐漸增強；從第7 d開始，發(fā)酵液的抑菌活性開始下降。確定第6 d為最佳發(fā)酵時間。

表3 不同培養(yǎng)時間對發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.3.3 不同溫度對發(fā)酵液抑菌活性的影響

不同溫度的發(fā)酵處理測定其對枯草芽孢桿菌的抑制率，其結(jié)果見表4，菌株F27在28℃時抑制率達到86.67%，菌株發(fā)酵液的活性最強。

表4 溫度對發(fā)酵液抑菌作用的影響

2.3.4 不同pH對發(fā)酵液抑菌活性的影響

不同pH的發(fā)酵處理測定其對枯草芽孢桿菌的抑制率，其結(jié)果見表5，在pH為7.0時，發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌的抑制率最高，隨著pH的升高或降低，發(fā)酵液的活性都有所下降。當pH小于5.0或大于10.0時，菌株F27發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌的抑制率幾乎為0。所以pH為7.0為最佳發(fā)酵pH。

表5 pH對發(fā)酵液抑菌作用的影響

2.3.5 不同裝液量的影響

裝液量會影響菌株發(fā)酵過程中的含氧量，進而影響菌株的生長和代謝產(chǎn)物的生成。所以不同裝液量的氧氣含量是非常重要的。由表6可知，當裝液量小于50 mL時，隨著裝液量的增加菌株發(fā)酵液的抑菌活性也增強，當裝液量達到50 mL時發(fā)酵液的活性達到最大，之后隨裝液量增加發(fā)酵液的抑菌活性反而降低。故最佳裝液量為50 mL。

表6 裝液量對發(fā)酵液抑菌作用的影響

2.4 發(fā)酵液穩(wěn)定性研究

選用枯草芽孢桿菌作為指示菌。

2.4.1 發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性研究

發(fā)酵液經(jīng)過不同溫度處理后的熱穩(wěn)定性的結(jié)果見表7，發(fā)酵液的抑菌活性隨著溫度的升高而明顯降低。因此，菌株F27的發(fā)酵液（代謝產(chǎn)物）不耐熱，對高溫耐受性很差。

表7 發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性研究

2.4.2 發(fā)酵液的pH耐受性研究

發(fā)酵液經(jīng)過不同的pH處理后其抑制率見表8，菌株發(fā)酵液在pH為7.0時的活性最高，在酸性和堿性條件下，抑菌活性都有所下降，在pH為3.0時抑制率為0。可以得出菌株F27的發(fā)酵產(chǎn)物對酸堿的耐受性很差。

表8 發(fā)酵液的pH耐受性研究

2.4.3 發(fā)酵液紫外線照射研究

發(fā)酵液經(jīng)不同時間的紫外線處理后對枯草芽孢桿菌的抑菌活性結(jié)果見表9，隨著照射的時間增長，發(fā)酵液的抑菌活性也有所下降，經(jīng)照射50 min后抑菌效果幾乎為0。可以得出菌株F27的代謝產(chǎn)物受紫外線照射的影響很大，且對紫外線的耐受性很差。

表9 發(fā)酵液紫外線照射研究

3 討論與結(jié)論

放線菌是一類微生物資源菌[21]，能夠代謝產(chǎn)生多種活性物質(zhì)。從微生物中獲得的22 500種[22]生物活性化合物中，有45%[22]是來自放線菌，并能抑制其他微生物的生長。張孟等[23]從海洋中分離到具有抑菌作用的小單孢菌屬，并對其抑菌活性物質(zhì)進行了熱穩(wěn)定性、pH耐受性、紫外照射和各種酶處理等研究；張志斌等[24]從植物根際分離到具有抑制真菌的植物內(nèi)生放線菌，并從菌株發(fā)酵液中分離出抑菌活性化合物。放線菌還可以通過對土壤和植物根系間的碳源競爭，可以有效抑制病原菌的生長，最后達到防止植物受到病原菌污染的目的[25]。

本研究從高黎貢山百花嶺國家自然保護區(qū)土壤中共分離到放線菌57株。對分離得到的57株放線菌發(fā)酵液采用濾紙片法進行抑菌活性的測定，篩選出13株放線菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌具有抑菌作用。其中菌株F27對3種指示菌都具有抑菌作用，并且抑菌效果最好，經(jīng)測定抑菌直徑都在16 mm以上。通過對菌株F27的顯微特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征觀察，初步確定菌株F27為孢囊鏈霉菌屬。對菌株F27的發(fā)酵條件進行研究，其最佳發(fā)酵時間為6 d，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值7.0，培養(yǎng)溫度為28℃，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為培養(yǎng)基1，裝液量50 mL/250 mL。通過對發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性研究，初步判斷菌株F27的熱穩(wěn)定性、紫外線照射性和pH耐受性都比較差。微生物在發(fā)酵過程中是活性物質(zhì)不斷積累的過程，菌株F27怎樣充分利用發(fā)酵條件，提高發(fā)酵效率，從而獲得高質(zhì)量抗生素，具有進一步研究的意義。