抑菌放線菌篩選鑒定及其發酵條件和發酵產物穩定性的研究

晏愛芬 余 麗 司紅艷 韋胡偵

（保山學院 資源環境學院，云南 保山 678000）

抗生素(antibiotics)是由各種微生物或高等動植物在其生命活動過程中所產生的一類次級代謝產物[1]，具有抗病原體或干擾其他生活細胞發育功能的作用。其中大家最為熟知的就有鏈霉素(Streptomycin)、殺稻瘟菌素（Blasticidin）、多抗霉素（Polyoxin）和井岡霉素（Validamycin）等。鏈霉素是從一種灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)的發酵液中提取的抗菌素，對植物細菌病害的防治效果較好，被廣泛用來防治蔬菜、花卉和果樹栽培的病害[2]；殺稻瘟菌素[3]是一種肽基核苷抗生素，由灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)代謝產生，主要通過干擾細胞核糖體中肽鍵的形成來抑制蛋白質的生物合成，在農業生產中被大量應用于水稻稻熱病的防治；多抗霉素[4]是由金色鏈霉菌（Streptomyces aureus）代謝所產生的抗生素，屬于廣譜性殺菌劑；井岡霉素[5]是由吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）代謝所產生的抗真菌劑，能夠防治水稻病原真菌水稻紋枯病菌（Rhi?zoctonia solani）感染所引起的紋枯病害。

放線菌是與人類生產和生活關系密不可分的一類革蘭氏陽性細菌，當前使用的抗生素約占70%由各類放線菌產生而來。除抗生素外，部分放線菌還能代謝產生各種酶制劑[6]、維生素和有機酸等。海洋、湖泊、土壤、動植物體內，甚至極端環境中都能找到放線菌的蹤跡，其中土壤中的放線菌含量最高、種類最多。劉曉飛等[7]從黑龍江黑土中分離篩選到產藍色素的放線菌，能抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長；李菲等[8]從廣西茅尾海紅樹林自然保護區土壤中共分離到444株放線菌，篩選出具有功能酶活性的菌株56株。高黎貢山豐富多樣的地貌類型為放線菌的篩選提供了更多的便利。本研究從高黎貢山國家級自然保護區百花嶺采集土壤，采用富集培養和劃線分離法，分離土壤放線菌，并以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌作為指示菌來篩選具有抑菌活性的放線菌。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品

采自高黎貢山國家級自然保護區百花嶺。

1.1.2 培養基

高氏1號培養基的配制參考李麗等(2018)[9]的研究方法；

牛肉膏蛋白胨培養基的配制參考戴航宇等(2020)[10]的研究方法。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤放線菌的篩選

將采集到的土壤濕土或風干樣品稱取5 g，加入到45 mL無菌水的三角瓶中，充分震蕩并進行沉淀，吸取上清液用無菌水稀釋成10?2～10?3的菌懸液，取0.1 mL在高氏1號培養基平板表面涂布均勻，28℃培養1 w。

用接種針挑取培養好的放線菌單菌落于高氏一號培養基上，用平板劃線法[11]進一步分離純化，培養6 d～7 d后形成單菌落，挑取單菌落于斜面培養基上劃線培養，28℃培養1 w左右，于4℃冰箱保存備用。

1.2.2 抑菌放線菌的篩選

用接種針分別將分離純化好的放線菌依次接種到裝有100 mL高氏1號液體培養基的三角瓶中（已滅菌），置于28℃、轉速為195 rpm的培養箱中培養6 d，培養液用0.22 μm濾膜過濾，濾液4℃保存備用。

將指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，由保山學院微生物試驗室提供）置于37℃、200 rpm，恒溫培養12～24 h。再用移液槍各吸取0.1 mL菌液，均勻涂布在牛肉膏蛋白胨培養基上，待20 min～30 min菌液滲入培養基后，用滅菌的鑷子夾取4張直徑為5 mm的濾紙片，等距離的放在平板上，用無菌移液槍吸取200 μL的放線菌發酵濾液分別滴在3張濾紙片上，其中一張濾紙片滴加等量的無菌水做對照，做好標記后重復三次，在37℃的培養箱中培養12 h～24 h后觀察和測量抑菌圈直徑，篩選出具有抑菌活性的菌株。

1.2.3 放線菌的初步分類鑒定

1.2.3.1 菌株的培養特征

在高氏一號培養基上接種放線菌，28℃培養1 w，觀察菌落的形態和生長情況[12]。

1.2.3.2 菌株的顯微特征

將滅菌的蓋玻片以45度角斜插入高氏一號培養基上，再在蓋玻片一側接種放線菌，28℃培養1周，菌絲生長并附著于蓋玻片上，輕輕拔出蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌絲和孢子的形態[13]。

1.2.3.3 菌株的生理生化特征

明膠液化試驗：在明膠液化培養基斜面上接種菌種，28℃培養，于接種后第5d、第10d、第15 d將斜面培養基放到4℃，30 min后觀察明膠液化程度，明膠水解陽性為菌落周圍明膠轉變為液體狀態[14]。

淀粉水解試驗：在淀粉水解培養基（可溶性淀粉5.0 g，NaCl 0.25 g，MgCO30.5 g，KNO30.5 g，KH2PO40.2 g，瓊脂粉10.0 g，蒸餾水500 mL，pH 7.2～7.4）平板上接種菌株，28 ℃培養1周，滴加幾滴碘酒于菌落附近，若淀粉不變藍而是形成了透明圈，則有淀粉酶產生，圈越大說明淀粉酶活性越強[15]。

纖維素水解試驗：把剪好的濾紙條的一端浸沒在纖維素分解培養基試管中，滅菌，在液面以上的濾紙條上接種放線菌，28℃培養1 w，如果菌株產生纖維素酶則能水解濾紙條或者使其折斷或變薄[16]。

牛奶的凝固與胨化試驗：在脫脂牛奶管（牛奶500 mL，CaCO30.1 g）中接種菌株，28℃培養1～2周，凝固為牛奶出現凝塊，胨化為凝固后有液體出現且凝塊進一步水解成液體[17]。

產生硫化氫的試驗：在硫化氫產生培養基中接種放線菌，28℃培養1 w，若有硫化氫產生則培養基會產生黑色素[18]。

1.2.4 發酵條件對發酵液抑菌活性的影響

將篩選到的抑菌放線菌采用以下不同發酵條件進行發酵，過濾后取發酵液原液，采用生長速率法測定其對指示菌的抑菌率，篩選抑菌活性最優的發酵條件。重復三次，取平均值。以未加放線菌菌株的發酵液作為對照。

1.2.4.1 不同發酵培養基的影響

采用4種培養基[12]，各取50 mL裝入250 mL的三角瓶中28℃，280 r/min搖床培養6 d～7 d后取樣，測抑菌率。

1.2.4.2 發酵時間的影響

在250 mL三角瓶中加入50 mL液體發酵培養基，195 rpm，28℃恒溫培養，接種后第3 d、第4 d、第5 d、第6 d、第7 d、第8 d后取樣，測抑菌率。

1.2.4.3 不同溫度的影響

在250 mL三角瓶中加入50 mL液體發酵培養基（pH=7.0），分別于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃振蕩培養1 w[19]，測抑菌率。

1.2.4.4 不同pH的影響

將液體發酵培養基的pH分別調為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，各取50 mL培養基轉移到250 mL三角瓶中，195 rpm，28℃振蕩培養1 w，測抑菌率。

1.2.4.5 不同裝液量的影響

分別在250 mL的三角瓶中加入40mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL發酵培養基，于195 rpm，28℃振蕩培養1 w，測抑菌率。

1.2.5 發酵產物穩定性的研究

將篩選到的抑菌放線菌進行發酵培養，過濾后取發酵液原液分別置于不同溫度，不同pH值和紫外條件下處理后，采用生長速率法，測定其對指示菌的抑菌率。重復三次，求平均值。以未加放線菌菌株的發酵液做對照。

1.2.5.1 熱穩定性

在1.5 mL離心管中加入1 mL放線菌發酵液，分別于20℃、40℃、60℃、80℃水浴處理30 min，測抑制率。

1.2.5.2 pH耐受性

將放線菌發酵液的pH分別調到3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，然后在4℃的冰箱中靜置24 h后將pH調回到7.0，取樣測抑菌率。

1.2.5.3 發酵產物的紫外線耐受性

將菌株發酵液放置于無菌空平板中，開蓋放置在紫外線[20]下，分別在10，20，30，40，50 min時取樣測抑菌率。

2 結果與分析

2.1 放線菌的分離及抑菌活性的測定

從采集到的土壤中分離得到放線菌57株。采用濾紙片法對57株放線菌發酵液進行抑細菌活性的測定，測定結果顯示有13株放線菌對細菌具有抑菌作用，其中菌株F27對三種指示菌均具有抑菌作用，且抑菌效果最好，抑菌直徑都在16 mm以上，如圖1所示。

圖1 菌株F27抑菌放線菌對不同指示菌產生的抑菌圈

2.2 菌株的初步分類和鑒定

2.2.1 菌株F27的菌落培養特征

由圖2可知，菌株F27的背面呈現淺黃色，正面呈現灰白色，油亮狀，近圓形，形狀較規則，菌落較厚，表面濕潤，菌株邊緣一圈為白色。表面有小孔，凹凸不平。

圖2 菌株F27在高氏一號培養基上的培養特征

2.2.2 菌株F27的顯微特征

圖3所示菌株F27在顯微鏡下菌絲呈絲狀分支，直徑較細。孢子絲盤卷形成包囊，生長在氣生菌絲的頂端。

圖3 顯微鏡下菌株F27的菌絲形態

2.2.3 菌株F27的生理生化特征

對菌株F27進行生理生化特征試驗，其結果見表1。

表1 菌株F27的生理生化特征

由表1可知，菌株F27能使明膠液化，可使淀粉水解，纖維素水解陰性，可使牛奶凝固和胨化，產黑色素。

由以上菌落形態特征、顯微特征、生理生化特征分析，根據放線菌分類系統，可初步確定菌株F27為孢囊鏈霉菌屬（Streptospo?rangium）。孢囊鏈霉菌屬的放線菌具有由氣生菌絲的孢子絲形成的孢囊，它長在氣生菌絲主絲或側絲的頂部，孢囊內部產生多個包囊孢子。由此初步確定菌株F27為孢囊鏈霉菌屬。

2.3 發酵條件研究

指示菌選用枯草芽孢桿菌。

2.3.1 發酵培養基對發酵液抑菌活性的影響

采用4種不同配方的培養基對菌株F27進行培養，用生長速率法測定發酵液的抑制率，其結果見表2，菌株F27的4種發酵培養基對枯草芽孢桿菌都有抑制作用，其中最強的是發酵培養基1，其抑制率達到50%。

表2 不同發酵培養基對發酵液抑菌活性的影響

2.3.2 發酵培養時間對發酵液抑菌活性的影響

測定發酵液在第3、4、5、6、7、8 d對枯草芽孢桿菌的抑制率。其結果見表3，從第3 d到第6 d，菌株F27發酵液的抑菌活性在逐漸增強；從第7 d開始，發酵液的抑菌活性開始下降。確定第6 d為最佳發酵時間。

表3 不同培養時間對發酵液抑菌活性的影響

2.3.3 不同溫度對發酵液抑菌活性的影響

不同溫度的發酵處理測定其對枯草芽孢桿菌的抑制率，其結果見表4，菌株F27在28℃時抑制率達到86.67%，菌株發酵液的活性最強。

表4 溫度對發酵液抑菌作用的影響

2.3.4 不同pH對發酵液抑菌活性的影響

不同pH的發酵處理測定其對枯草芽孢桿菌的抑制率，其結果見表5，在pH為7.0時，發酵液對枯草芽孢桿菌的抑制率最高，隨著pH的升高或降低，發酵液的活性都有所下降。當pH小于5.0或大于10.0時，菌株F27發酵液對枯草芽孢桿菌的抑制率幾乎為0。所以pH為7.0為最佳發酵pH。

表5 pH對發酵液抑菌作用的影響

2.3.5 不同裝液量的影響

裝液量會影響菌株發酵過程中的含氧量，進而影響菌株的生長和代謝產物的生成。所以不同裝液量的氧氣含量是非常重要的。由表6可知，當裝液量小于50 mL時，隨著裝液量的增加菌株發酵液的抑菌活性也增強，當裝液量達到50 mL時發酵液的活性達到最大，之后隨裝液量增加發酵液的抑菌活性反而降低。故最佳裝液量為50 mL。

表6 裝液量對發酵液抑菌作用的影響

2.4 發酵液穩定性研究

選用枯草芽孢桿菌作為指示菌。

2.4.1 發酵液的熱穩定性研究

發酵液經過不同溫度處理后的熱穩定性的結果見表7，發酵液的抑菌活性隨著溫度的升高而明顯降低。因此，菌株F27的發酵液（代謝產物）不耐熱，對高溫耐受性很差。

表7 發酵液的熱穩定性研究

2.4.2 發酵液的pH耐受性研究

發酵液經過不同的pH處理后其抑制率見表8，菌株發酵液在pH為7.0時的活性最高，在酸性和堿性條件下，抑菌活性都有所下降，在pH為3.0時抑制率為0。可以得出菌株F27的發酵產物對酸堿的耐受性很差。

表8 發酵液的pH耐受性研究

2.4.3 發酵液紫外線照射研究

發酵液經不同時間的紫外線處理后對枯草芽孢桿菌的抑菌活性結果見表9，隨著照射的時間增長，發酵液的抑菌活性也有所下降，經照射50 min后抑菌效果幾乎為0。可以得出菌株F27的代謝產物受紫外線照射的影響很大，且對紫外線的耐受性很差。

表9 發酵液紫外線照射研究

3 討論與結論

放線菌是一類微生物資源菌[21]，能夠代謝產生多種活性物質。從微生物中獲得的22 500種[22]生物活性化合物中，有45%[22]是來自放線菌，并能抑制其他微生物的生長。張孟等[23]從海洋中分離到具有抑菌作用的小單孢菌屬，并對其抑菌活性物質進行了熱穩定性、pH耐受性、紫外照射和各種酶處理等研究；張志斌等[24]從植物根際分離到具有抑制真菌的植物內生放線菌，并從菌株發酵液中分離出抑菌活性化合物。放線菌還可以通過對土壤和植物根系間的碳源競爭，可以有效抑制病原菌的生長，最后達到防止植物受到病原菌污染的目的[25]。

本研究從高黎貢山百花嶺國家自然保護區土壤中共分離到放線菌57株。對分離得到的57株放線菌發酵液采用濾紙片法進行抑菌活性的測定，篩選出13株放線菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌具有抑菌作用。其中菌株F27對3種指示菌都具有抑菌作用，并且抑菌效果最好，經測定抑菌直徑都在16 mm以上。通過對菌株F27的顯微特征、培養特征和生理生化特征觀察，初步確定菌株F27為孢囊鏈霉菌屬。對菌株F27的發酵條件進行研究，其最佳發酵時間為6 d，發酵培養基初始pH值7.0，培養溫度為28℃，最佳發酵培養基為培養基1，裝液量50 mL/250 mL。通過對發酵產物穩定性研究，初步判斷菌株F27的熱穩定性、紫外線照射性和pH耐受性都比較差。微生物在發酵過程中是活性物質不斷積累的過程，菌株F27怎樣充分利用發酵條件，提高發酵效率，從而獲得高質量抗生素，具有進一步研究的意義。