木姜子精油提取工藝與抑菌效果的研究

余麗 宋露

（保山學院資源環境學院，云南 保山 678000）

芳香植物用作香料的歷史悠久，2 000年前就有大量文獻[1?2]記載了用芳香植物制作香料的歷史，如用于制作香燭、防腐劑、香精、香水、化妝品、藥品、食品和飲料的調味料以及抗氧化劑等[3?4]。由于芳香植物精油具有抑菌效果、抗氧化性和對生物的趨避性等天然特性，近些年以來，很多芳香植物成了較為熱門的研究領域。

木姜子(Litsea pungensHemsl.)屬樟科，木姜子屬，落葉小喬木木姜子種，別名山胡椒、山蒼子，其經濟價值主要體現為中藥材及木姜子精油提取應用[5?7]。木姜子性味辛、微苦，無毒，枝、葉均具有芳香味，根皮及葉可供藥用，可作為中藥材，有溫中行氣，止痛燥濕，健脾消食，解毒消腫的作用。目前對木姜子屬植物的揮發油成分及生物活性的研究較多[8?10]，其主要成分有醛類和醇類，其中檸檬醛含量豐富(15.89%)，所散發的檸檬香氣是重要的香料，具有平喘和抗菌功效[11?12]，同時也是合成紫羅蘭酮的主要原料。但關于木姜子精油提取工藝的研究不多，本研究采用正交法優化了水蒸氣蒸餾法提取木姜子果實中精油的條件，并研究了該木姜子精油的抑菌效果，為木姜子資源開發及木姜子精油的利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

木姜子：購買產自四川自貢的木姜子干果；

大腸桿菌（Eccherichia coli），金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aurens)，銅綠假單胞菌(Pseudomo?nas alcaligebes)，黑曲霉(Aspergillus niger)，釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，由保山學院微生物實驗室提供。

1.2 實驗儀器

電子天平、無菌操作臺、粉碎機、微量移液管等。

1.3 試劑和培養基

試劑：氯化鈉，吐溫80。

培養基：馬鈴薯培養基（PDA）、牛肉膏蛋白胨培養基（NA）。

1.4 方法

1.4.1 水蒸氣蒸餾法提取精油

將木姜子果實用破壁機打碎進行避光儲存，稱取25 g木姜子，按照一定料液比加入一定量的氯化鈉，浸泡一定的時間后利用水蒸氣蒸餾法[13?14]進行精油提取，將提取出的木姜子精油置于棕色瓶中放入4℃冰箱中儲藏。根據公式計算精油提取率[14?17]。

V：木姜子精油提取體積

M：木姜子質量

1.4.2 單因素實驗

準確稱取木姜子25.0 g，選擇浸泡時間（0 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h）、料液比（1︰15、1︰20、1︰25、1︰30、1︰35）、提取時間（1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h）、NaCl濃度(0 g/L、15 g/L、30 g/L、45 g/L、60 g/L)4個因素，在某一單因素為變量的條件下（固定因素分別取料液比1：25，浸泡3 h，NaCl濃度30 g/L，提取時間2.5 h）進行精油提取，計算精油得率。考察各因素對木姜子精油得率的影響，用于確定提取精油條件的最佳范圍。

1.4.3 正交實驗

在單因素試驗的基礎上，選取浸泡時間（A）、提取時間（B）、料液比（C）、氯化鈉（D）四個因素通過L9（34）進行正交試驗設計，正交試驗各因素水平及試驗方案見表1、表2。

表1 正交試驗因素與水平設計

表2 正交設計試驗方案

1.4.4 木姜子精油的抑菌活性

采用倍比稀釋法探討木姜子精油對不同菌種的最小抑菌濃度（MIC）。具體操作為：首先將木姜子精油分別配制成濃度為0.125%、0.250%、0.500%、1.000%、2.000%的溶液，取各濃度溶液1 mL分別與15 mLPDA培養基、NA培養基混合制成含不同濃度木姜子精油的平板培養基。其次取已調至合適濃度（細菌、酵母菌濃度為108cfu/mL,霉菌孢子濃度調成105cfu/mL）的5種待測菌懸液各200 μL均勻涂布于相應培養基中（細菌為NA，酵母菌、霉菌為PDA），每個濃度做3組重復。最后細菌在37℃下培養24 h，酵母菌、霉菌在28℃下培養48 h～72 h，觀察菌落生長情況，將平板中完全不出現菌落生長的最低濃度作為提取液的MIC值。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 浸泡時間對木姜子精油提取的影響

由圖1可知，在取料液比1：25，NaCl濃度30 g/L，提取時間2.5 h條件下，隨著浸泡時間的延長，精油提取的量逐漸增加；當浸泡時間達到3.0 h時，木姜子精油的提取量最大，之后隨著浸泡時間的延長，木姜子精油提取的量逐漸下降。這是因為在浸泡3.0 h后已經達到飽和，隨著時間延長也不能再吸收水分，同時水分過多也會增加精油收集的難度。由圖1可知，精油提取的合適浸泡時間在2.0 h～4.0 h之間。

圖1 浸泡時間對木姜子精油提取的影響

2.1.2 料液比對木姜子精油提取量的影響。

由圖2可知，在浸泡3 h，NaCl濃度30 g/L，提取時間2.5 h條件下，隨著料液比的增加，木姜子精油的提取量逐漸增加；當料液比為1︰25時，木姜子精油提取量達到最高；之后隨著料液比的增加木姜子精油的提取量逐漸下降。這可能是因為當料液比小時水分分散不徹底影響出油率，料液比大時溶于水中的精油較多影響精油收集使精油得率降低。綜合多方面考慮，確定合適的料液比范圍為1︰20～1︰30之間。

圖2 料液比對木姜子精油提取量的影響

2.1.3 提取時間對木姜子精油的影響。

由圖3可知，在料液比1：25，浸泡3 h，NaCl濃度30 g/L條件下，隨著提取時間的增加，木姜子精油的提取量增加；當提取時間為3.0 h，木姜子精油的提取量達到最高；之后隨著提取時間的增加木姜子精油的提取量逐漸下降。這是因為提取3.0 h后，精油已基本被蒸餾出來，再延長時間也不會增加精油得率，同時精油是一種易揮發物質，提取時間過長也會使精油揮發導致精油損失。綜合提取效率、提取成本等多方面因素，確定精油合適的提取時間范圍為2.0 h～3.0 h之間。

圖3 提取時間對木姜子精油的影響

2.1.4 NaCl濃度對木姜子提取量的影響。

在精油提取中加入氯化鈉是為了加速油水混合物分層，同時鹽析作用也可降低精油在水中的溶解度，便于精油收集增加提取率。隨著濃度增加鹽析效果反而減弱，精油得率下降。由圖4可知，在料液比1：25，浸泡3 h，提取時間2.5 h條件下，隨著氯化鈉濃度的增加，木姜子精油的提取量逐漸增加；當氯化鈉濃度達到30 g/L時，木姜子精油的提取量達到最大；之后隨著氯化鈉濃度的增加，木姜子精油的提取量逐漸下降。綜合考慮，確定氯化鈉濃度合適范圍為15 g/L～45 g/L之間。

圖4 NaCl濃度對木姜子提取量的影響

2.2 正交試驗結果分析

根據單因素試驗確定木姜子精油提取各因素的合適范圍，進行四因素三水平正交試驗，結果見表3、表4。

表3 木姜子精油提取水平設計

表4 正交實驗結果

根據正交試驗結果，各因素對木姜子精油提取的影響順序為D＞C＞A＞B,即氯化鈉濃度的變化對木姜子影響最大，其次是料液比，再然后是浸泡時間，最后是提取時間。最佳參數組合為A1B2C2D2或A1B2C3D2,考慮成本因素，本實驗采用A1B2C2D2組合，即木姜子浸泡2.0 h，提取2.5 h，料液比為1：25，氯化鈉濃度為30 g/L，在此條件下精油得率為2.01 mL/100g。

2.3 木姜子精油的抑菌活性

由表5可知，抑菌效果隨木姜子精油濃度減小而降低，其中對金黃色葡萄球菌的MIC值為0.25%，對銅綠假單胞菌的MIC值為2.000%，對酵母菌、黑曲霉、大腸桿菌的MIC值為0.500%。這說明木姜子精油對金黃色葡萄球菌有較強的抑菌作用。

表5 MIC值的測定

3 結論和討論

通過正交實驗結果得出水蒸氣蒸餾法提取木姜子精油的最佳方案是木姜子浸泡2.0 h，提取2.5 h，料液比為1：25，氯化鈉濃度為30g/L。此方案提取出的精油品質較好，精油得率2.01 mL/100 g。同時水蒸氣蒸餾法所得精油具有無有機溶劑殘留、安全無毒、可直接使用等特點[13,15]，有利于對其進行深入研究。

木姜子精油對5種受試菌均有不同程度的抑制作用，最小抑菌濃度的測定得到各菌種的MIC值：金黃色葡萄球菌的MIC值為0.25%，銅綠假單胞菌的MIC值為2.000%，酵母菌、黑曲霉、大腸桿菌的MIC值為0.500%，其中金黃色葡萄球菌對木姜子精油敏感性較強，這個結果與項昭保[8]研究結果比較相似。這說明木姜子精油具有很好的抑菌作用和重要的藥用價值。

木姜子揮發油成分研究表明[7?12]，揮發油組成主要包括萜烯類、醛類、醇類和酮類，同時木姜子不同的部位其揮發油成分有很大差別[11]。本研究采用水蒸氣蒸餾法提取木姜子果實精油，可以為更有效的提取研究和利用木姜子精油提供一定的理論依據。木姜子精油較好的抑菌性能，也能夠為天然防腐劑的開發應用提供一定的理論基礎。