膿毒癥患者外周血Th1/Th2和Th17/Treg平衡變化及臨床意義

王建峰，楊楠楠

(焦作市第二人民醫院重癥醫學科，河南 焦作 454000)

CD4+T細胞具有較高異質性，根據其分泌細胞因子和不同功能可分為Th1、Th2、Th17、調節性T細胞(Treg)等亞群，在功能及分化中，Th1/Th2和Th17/Treg是2對互相拮抗的體系，在維持機體免疫平衡中具有主要作用，若出現失衡，則會引起免疫功能異常，發生免疫性、腫瘤、炎癥等疾病[1]。有研究證實[2]，Th1/Th2和Th17/Treg的平衡變化與肺癌、肝細胞癌、腎癌等癌癥的發生、發展、預后有密切關系，其能預示癌癥的進展。隨著社會經濟的發展，交通越來越發達，也顯著增加了交通事故發生率，研究顯示[3]，嚴重創傷后，機體常出現全身炎癥反應及免疫紊亂，是導致患繼發感染及膿毒癥的主要原因。但目前尚沒有研究報道Th1/Th2和Th17/Treg平衡變化與膿毒癥的關系，基于此本研究報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2017年1月至2019年1月收治的68例多發傷患者，根據是否出現膿毒癥分為2組，無膿毒癥組43例，其中男33例，女10例；年齡17～68歲，平均(35.54±2.64)歲；受傷原因：2例毆擊，4例擠壓，6例銳器刺入，7例高處墜落，24例交通事故；創傷嚴重程度(injury severe score，ISS)評分17～47分，平均(35.54±2.64)分。膿毒癥組25例，其中男19例，女6例；年齡18～67歲，平均(35.71±2.25)歲；受傷原因：1例毆擊，2例擠壓，3例銳器刺入，4例高處墜落，15例交通事故；ISS評分16～50分，平均(36.66±2.72)分。納入標準：(1)膿毒癥診斷符合《中國膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)》[4]中相關標準；(2)受傷前1個月內無感染性疾病者；(3)患者及家屬均知情研究；(4)受傷指入院時間<24 h；(5)ISS評分≥16分。排除標準：(1)妊娠及哺乳期婦女；(2)長期使用糖皮質激素者；(3)慢性疾病者；(4)免疫性疾病者；(5)年齡<14歲者。另選取同時期來我院體檢健康者50例為對照組，其中男39例，女11例；年齡18～65歲，平均(35.28±2.39)歲；3組研究對象年齡、性別構成及兩組患者ISS評分無差異(P>0.05)。本研究經倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 指標檢測

主要試劑：PE anti-human IL-17A、647 anti-human FOXP3、PE/Cy5 anti-human CD25、FITC anti- human CD4，以上抗體及同型抗體均由美國BD公司提供。收集所有研究對象入院后24 h內9 mL外周血，分為3份，各3 mL。第1份促凝：3000 r/min離心10 min，取上清液，置于-80 ℃環境下待檢，采用酶聯免疫法(ELISA)檢測血清IFN-γ、轉化生長因子β(TCF-β)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、白介素17(IL-17)、白介素23(IL-23)水平，試劑盒均由艾美捷科技有限公司提供，所有操作嚴格試劑盒說明書進行；第2份給予肝素鋰抗凝：淋巴細胞分離后，采用實時熒光定量(RT-PCR)檢測CD4+、CD25+Foxp3+Treg轉錄因子Foxp3和Thl7轉錄因子RORγr mRNA水平，Trizol一步法提取總RNA，根據試劑盒說明書反轉錄cDNA，RT-PCR檢測RORγr、Foxp3 mRNA水平，人Foxp3上、下游引物：5’-TGACCAAGGCTTCATCTGTG-3’、5’-GAGGA ACTCTGGGAATGTGC-3’，擴增片段長度：179 bp；人RORγr上、下游引物：5’-CCTGGGCTCCTCCCCTCACC-3’、5’-TCTCTCTGCCCTCAGCCTFGCC-3’，擴增片段長度：170 bp；人β-actin上、下游引物：5’-AGCGAGCATCCCCCA AAGTT-3’、5’-GGGCACGA AGGCTCATCATF-3’，擴增片段長度：284 bp；引物均東莞太力生物工程有限公司合成；第3份肝素鋰抗凝：淋巴細胞分離后，采用流式細胞術(ECM)檢測CD4+、CD25+、Th1、Th2、Th17、Treg數量及比值，所有試驗步驟均根據說明書和Carrier Y等試驗進行，使用BD FACSDiva軟件進行分析。

1.2.2 病情嚴重程度評價

膿毒癥患者入院后使用膿毒癥相關序貫器官衰竭評估(sepsis-related organ failure assessment，SOFA)病情嚴重程度，包括呼吸、血液、肝臟、循環、神經、腎臟6個項目，總分值0～44分，得分越高病情越嚴重。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 3組外周血Th1、Th2、Th17、Treg數量及比值對比

膿毒癥組外周血Th2、Th17、Treg、Th17/Treg比值明顯高于無膿毒癥組和對照組，Th1和Th1/Th2比值明顯低于無膿毒癥組和對照組(P<0.05)；無膿毒癥組外周血Th2、Treg、Th17/Treg比值明顯高于對照組，Th1和Th1/Th2比值明顯低于對照組(P<0.05)，Th17與對照組對比無差異(P>0.05)，見表1。

表1 3組外周血Th1、Th2、Th17、Treg數量及比值對比

2.2 3組外周血相關因子mRNA水平對比

膿毒癥組Foxp3和RORγr mRNA水平明顯高于無膿毒癥組和對照組，無膿毒癥組Foxp3和RORγr mRNA水平明顯高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 3組外周血相關因子mRNA水平對比

2.3 3組外周血Th1/Th2和Th17/Treg細胞因子含量對比

膿毒癥組外周血IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23水平明顯高于無膿毒癥組和對照組，IFN-γ水平明顯低于無膿毒癥組和對照組(P<0.05)；無膿毒癥組IL-6、IL-10水平明顯高于對照組，IFN-γ水平明顯低于對照組(P<0.05)；膿毒癥組與無膿毒癥組TCF-β水平對比無差異(P>0.05)，均明顯高于對照組(P<0.05)；無膿毒癥組與對照組IL-4、IL-17、IL-23水平對比無差異(P>0.05)，見表3。

表3 3組外周血Th1/Th2和Th17/Treg細胞因子含量對比

2.4 膿毒癥組SOFA評分與外周血Th1、Th2、Th17、Treg數量的相關性

膿毒癥組SOFA評分為(12.76±2.89)分，Pearson相關性分析顯示，膿毒癥組SOFA評分與外周血Th1呈負相關，與Th2、Th17、Treg呈正相關(P<0.05)，見表4。

表4 膿毒癥組SOFA評分與外周血Th1、Th2、Th17、Treg數量的相關性

3 討 論

CD4+T細胞為人體免疫系統重要細胞，在不同細胞因子作用下，Th細胞前體(Th0)可分化為不同細胞亞群，包括Th1、Th2、Th17、Treg等，最早由李呼倫教授于2009年提出Th1/Th2和Th17/Treg細胞亞群功能失衡，且隨著研究的深入，大量試驗證實，各亞群可分泌具備各自功能的細胞因子，并能互相進行影響制約[5]。研究表明[6]，Th1細胞可分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2等細胞因子，介導并激活巨噬和細胞毒性T細胞，對B細胞功能進行抑制。Th2細胞可分泌IL-4、IL-10等多種細胞因子，研究顯示[7]，其能激活B細胞，并分化產生抗體，介導體液免疫反應。鐘興明等[8]在多囊卵巢綜合征患者研究中發現，患者存在Th1細胞因子IL-2、IFN-γ低表達，Th2細胞因子IL-6、IL-10高表達，導致Th1向Th2飄移，抑制細胞免疫。Tong等[9]研究也證實，Th1細胞誘導免疫應答可對腫瘤增生進行抑制，因此若Th2細胞過度表達，使Th1處于劣勢，則會抑制細胞免疫功能，導致腫瘤進一步發展。結果顯示，膿毒癥組外周血Th2明顯高于無膿毒癥組和對照組，Th1、Th1/Th2明顯低于無膿毒癥組和對照組，無膿毒癥組外周血Th2明顯高于對照組，Th1和Th1/Th2比值明顯低于對照組(P<0.05)，說明Th1和Th2參與了炎癥反應，且結果顯示，膿毒癥組外周血IL-4、IL-6、IL-10水平明顯高于無膿毒癥組和對照組，IFN-γ水平明顯低于無膿毒癥組和對照組，無膿毒癥組IL-6、IL-10水平明顯高于對照組，IFN-γ水平明顯低于對照組(P<0.05)；膿毒癥組與無膿毒癥組TCF-β水平對比無差異，均明顯高于對照組(P<0.05)；無膿毒癥組與對照組IL-4水平對比無差異(P>0.05)，說明膿毒癥組和無膿毒癥組均存在Th1向Th2漂移的現象，且膿毒癥組表現明顯，由此提示膿毒癥和引起強烈免疫抑制。

Treg具有免疫無能性和免疫抑制性特征，在機體免疫維持中扮演重要角色，其中Foxp3為控制Treg細胞功能和分化的重要基因，可通過釋放TGF-β、IL-10等細胞因子抑制自身反應性T細胞增殖活化，以維持自身免疫耐受[10-11]。Th17主要功能為募集活化中性粒細胞，可分泌TNF-α、IL-17等細胞因子，在多種炎癥反應和免疫性疾病中發揮重要作用，與Treg細胞分化間呈相互影響，功能上相互拮抗，共同維持機體免疫狀態，使機體處于免疫平衡狀態[12-13]。研究顯示，膿毒癥發生后機體處于代償性防疫狀態，即Treg與Th17細胞百分比均有所提升，但以Treg細胞為主，隨著病情加重，機體又會處于免疫抑制狀態，也會同時增加Treg與Th17細胞百分比，但主要以Th17細胞為主，均提示膿毒癥患者Th17/Treg處于失衡狀態[14]。結果顯示，膿毒癥組外周血Th17、Treg、Th17/Treg比值、IL-17水平、Foxp3和RORγr mRNA水平明顯高于無膿毒癥組和對照組，無膿毒癥組外周血Treg、Th17/Treg比值、Foxp3和RORγr mRNA水平明顯高于對照組(P<0.05)，無膿毒癥組與對照組IL-17水平對比無差異(P>0.05)，說明Th17和Treg也參與了炎癥反應。IL-23為維持Th17功能重要細胞因子，當缺乏IL-23參與，則會顯著降低IL-17水平[15]。結果顯示，膿毒癥組外周血IL-23水平明顯高于無膿毒癥組和對照組(P<0.05)，進一步證實Th17參與了炎癥反應，且存在Th17/Treg比值失衡，隨著病情的進展，其失衡進一步加強。SOFA評分是評估膿毒癥患者病情嚴重程度和預后常用評分，結果顯示，膿毒癥組SOFA評分與外周血Th1呈負相關，與Th2、Th17、Treg呈正相關(P<0.05)，說明膿毒癥患者Th1/Th2和Th17/Treg比值失衡還能反映病情進展和預后，可能作為患者膿毒癥發生和預后預測指標。

綜上所述，膿毒癥患者外周血存在明顯Th1/Th2和Th17/Treg比值失衡，與膿毒癥發生及發展有密切關系。