乙肝相關(guān)性肝癌組織中mTOR、HBx蛋白的表達及意義

金宏凱，劉星，高峰，藺廣榮

(1.錦州醫(yī)科大學；2.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；3.濱州市人民醫(yī)院普外科，山東 濱州 256610)

隨著人類生活水平的提高及生活方式的改變，肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)病率呈每年遞增的趨勢，成為最致命的癌癥之一[1]。90%以上為肝細胞癌，其主要病因與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)有關(guān)[2]。據(jù)統(tǒng)計，HBV攜帶者發(fā)生HCC的相對危險性是非攜帶者的10倍。由于其惡性程度高，起病隱匿，發(fā)覺時已處于中晚期，失去最佳手術(shù)時機[3]。因此探討其發(fā)病機制具有重大意義。

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種高度進化的保守的蘇氨酸/絲氨酸激酶，在細胞內(nèi)外生長信號和細胞代謝整合中發(fā)揮重要的作用[3]581-585。HBx基因是HBV基因組中最小的開放性讀碼框，包含四段重疊的開放閱讀框，分別編碼病毒折疊、核心蛋白、病毒聚合酶和調(diào)節(jié)性x蛋白(HBx)，其中HBx蛋白在調(diào)節(jié)肝癌細胞增殖、發(fā)展及凋亡發(fā)揮重要作用。目前國內(nèi)外文獻較少報道m(xù)TOR、HBx蛋白在乙肝相關(guān)性肝癌聯(lián)合表達研究。本研究通過免疫組織化學方法檢測在乙肝相關(guān)性肝癌中的mTOR和HBx兩項指標的表達情況，并探討臨床病理參數(shù)及預后與其表達的相互關(guān)系，提供一種關(guān)于乙肝相關(guān)性肝癌治療靶點的新思路，也希望為臨床上乙肝相關(guān)性肝癌的預后隨訪提供有意義的參考數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2010年1月至2015年5月于錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院行手術(shù)切除并由兩位高年資病理學家雙盲法觀察、確診無誤的肝癌組織及對應(yīng)的癌旁組織(距離癌灶>3 cm)標本共69例。所有患者臨床及隨訪資料完整，術(shù)前均未行放化療及其它抗腫瘤治療。所有患者均具有明確的HBV 病毒感染病史或 HBV-DNA 檢測陽性。69例肝癌患者中，男性40例，女性29例；年齡41～76歲，平均(54.8±12.3)歲；腫瘤直徑≤5 cm 30例，>5 cm 39例；腫瘤數(shù)目單發(fā)26例，多發(fā)43例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期42例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例；低分化38例，高中分化31例；甲胎蛋白(AFP)水平≤200 ng/mL 35例，>200 ng/mL 34例；獲得術(shù)后3～50個月隨訪者61例，失訪8例。參照2010年美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)分期方法進行臨床分期。本研究通過錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學倫理會審批，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 主要實驗試劑

一抗mTOR購自沈陽萬類生物科技有限公司；一抗HBx購自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司；即用型SABC免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫組化染色

免疫組織化學技術(shù)采用SABC法，一抗均按1∶200稀釋，具體操作按照試劑盒說明書進行。組織標本經(jīng)4%甲醛固定，進行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋等實驗步驟處理，以4 μm厚度進行連續(xù)切片，微波修復，3%雙氧水封閉內(nèi)源性過氧化物酶，之后進行血清封閉。依次加入一抗、二抗及Strept Avidin-Biotin Complex，隨后DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，最后采用中性樹膠封片。陰性對照為取代一抗的PBS。

結(jié)果判定：以細胞膜或細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色、黃色或棕褐色顆粒為陽性表達。本次實驗染色結(jié)果由兩位經(jīng)驗病理科醫(yī)生雙盲法獨立閱片。使用了半定量計分法，對陽性細胞進行計數(shù)：隨機選取5個200×的高倍鏡視野，根據(jù)每張切片的陽性細胞的百分率進行計數(shù)，小于5%記為0分，5%～25%(包括5%)記為1分，25%～50%(包括25%)記為2分，大于50%(包括50%)記為3分。著色強度分類按照：褐或棕褐色記為3分，黃或棕黃色記為2分，淡黃色記為1分，無著色記為0分。兩者記分相乘大于等于4分記為免疫組化陽性(+)，小于4分記為免疫組化陰性(-)。

1.4 隨訪

術(shù)后對患者每3個月進行1次定期隨訪，主要以門診復查或電話隨訪形式進行。隨訪截止時間為2018年9月30日。隨訪的主要內(nèi)容包括患者一般臨床資料及生存狀態(tài)。

1.5 統(tǒng)計學分析

運用 SPSS 22.0軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以百分比(%)作為表示，比較用χ2檢驗，相關(guān)性分析運用Spearman進行分析，選擇Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較用Log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 mTOR、HBx在癌組織及癌旁組織中的表達

mTOR、HBx主要定位于細胞膜或細胞質(zhì)內(nèi)，鏡下看到黃色或者棕褐色顆粒，癌旁組織不表達或局灶呈弱表達，見圖1、圖2。mTOR、HBx在癌組織(57.97%，66.67%)的表達均高于癌旁組織(11.59%，17.39%)，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(χ2分別為32.711、34.381，均P<0.001)。

圖1 mTOR、HBx在癌組織中的表達(SABC,200×)

圖2 mTOR、HBx在癌旁組織中的表達(SABC,200×)

2.2 mTOR、HBx蛋白表達與乙肝相關(guān)性肝癌臨床病理特征的關(guān)系

癌組織中mTOR、HBx蛋白的表達均與TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤大小、數(shù)目及AFP水平無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 mTOR、HBx蛋白表達與乙肝相關(guān)性肝癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 乙肝相關(guān)性肝癌組織中mTOR、HBx蛋白表達相關(guān)性

Spearman分析顯示癌組織中mTOR、HBx蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.644，P=0.000)，見表2。

表2 乙肝相關(guān)性肝癌組織中mTOR、HBx蛋白表達相關(guān)性

2.4 mTOR、HBx蛋白的表達與乙肝相關(guān)性肝癌患者預后之間的關(guān)系

在已獲得隨訪資料的61例患者中，mTOR和HBx共高表達37例，低表達20例。通過用Kaplan-Meier繪制生存分析曲線，發(fā)現(xiàn)高表達組中位生存時間為13個月，95%置信區(qū)間為10.754～15.246；低表達組為27個月，95%置信區(qū)間為22.671～31.329，經(jīng)Log-rank檢驗分析比較兩者具有統(tǒng)計學差異(P=0.031)，見圖3。

圖3 mTOR、HBx在癌組織中總生存率分析

3 討 論

自噬是溶酶體介導的細胞內(nèi)代謝分解的過程，其調(diào)節(jié)受多因素影響[4]。目前已發(fā)現(xiàn)40多種自噬相關(guān)蛋白參與腫瘤細胞的自噬通路。其中mTOR發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能。mTOR基因定位1p36.2，由2549個氨基酸編碼而成蛋白，分子量為280 KDa，是PI3K/Akt/mTOR信號通路的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導分子。在生物體內(nèi)以mTORC1和mTORC2兩種形式存在，通過逐級磷酸化下游蛋白來加速細胞周期、抑制細胞凋亡及提高腫瘤的活性[5]。mTORC1上游調(diào)控因子主要為胰島素、氧氣、生長因子、營養(yǎng)狀況及GMP/GTP等[6]。本質(zhì)是整合信號通路的中央細胞激酶，調(diào)節(jié)合成和分解代謝過程。mTORC2能磷酸化血清/糖皮質(zhì)激素激酶(SGK)家族成員，而SGK3的激活與腫瘤有關(guān)，能夠通過INPP4B增強PI3K信號[7]。目前已證實mTOR在胃癌[8]、乳腺癌[9]及肺癌[10]等多種腫瘤中表達上調(diào)。林凱煌等學者采用CCK-8法檢測不同濃度的mTOR抑制劑AZD2014(10、100、500、1000 nmol/L)對肝癌細胞增殖的作用，結(jié)果顯示10、100、500、1000 nmol/L的AZD2014均可顯著抑制肝癌細胞的增殖能力，抑制程度與其濃度呈正相關(guān)(P<0.05)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，mTOR在乙肝相關(guān)性肝癌組織中表達率高于癌旁組織，經(jīng)χ2檢驗差異有統(tǒng)計學意義。可見mTOR參與了乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生。本研究通過分析mTOR與乙肝相關(guān)性肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)mTOR表達與分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可見mTOR參與了乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)展。

HBx蛋白是一種能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、影響多種信號轉(zhuǎn)導通路、促進細胞增殖及干擾DNA修復等多功能的調(diào)節(jié)蛋白[12]，該蛋白是一個能夠引發(fā)肝癌的潛在機制，涉及到其在細胞內(nèi)的分布情況。病理組織學檢測結(jié)果表明，HBx蛋白在機體受到HBV感染的不同階段會出現(xiàn)不同的分布特征。在原發(fā)性肝細胞癌病例中能夠檢測到強烈彌散的核內(nèi)反應(yīng)，在急性或慢性的乙型肝炎病例中，則會出現(xiàn)局灶的胞漿和核內(nèi)分布[13]。通過體外實驗的結(jié)果，證實在培養(yǎng)細胞的胞質(zhì)和核內(nèi)都能檢測到HBX蛋白的相關(guān)表達，在核內(nèi)的表達強度較弱，并發(fā)現(xiàn)HBX在胞質(zhì)內(nèi)能夠激活信號傳導通路，在核內(nèi)能夠反式激活轉(zhuǎn)錄成分[14]。而本研究發(fā)現(xiàn)，HBx主要定位于細胞膜或細胞質(zhì)內(nèi)。范麗等[15]研究發(fā)現(xiàn)，HBx能夠促進肝癌細胞HepG2株中增殖、侵襲及血管新生分子的表達。本研究用免疫組織化學方法證實HBx蛋白在乙肝相關(guān)性肝癌組織中的表達高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義。本研究還發(fā)現(xiàn)HBx蛋白與分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。可見HBx蛋白與乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)，這一點與既往研究一致[16]。而對于HBx蛋白在肝癌中的發(fā)病機制尚未完全明確，HBx可通過反式激活作用促進白細胞介素18(IL-18)的表達，以Fas/FasL通路誘導細胞凋亡[17]。體外實驗表明，HBx還能通過激活Wnt/β-catenin、NF-κB、TGF-β等細胞信號傳導通路中參與肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，mTOR和HBx經(jīng)Spearman分析，兩者表達呈正相關(guān)(r=0.644，P=0.000)。現(xiàn)推測HBx可能通過PI3K/Akt/mTOR信號通路參與了肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移。既往研究表明，Hippo信號通路可以介導PTEN通過PI3K/AKT/mTOR信號通路促進肝細胞肝癌細胞增殖和成瘤[19]。而王慶亮研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)mTOR表達能提高人肝癌細胞SMMC-7721的熱療敏感性,其作用機制可能與誘導細胞凋亡及S期生長阻滯有關(guān)[20]。可見mTOR通過不同的信號途徑參與了肝癌的侵襲與發(fā)展。隨訪結(jié)果顯示，mTOR、HBx蛋白高表達組中位生存時間為13個月，低表達組中位生存時間為27個月，經(jīng)Log-rank檢驗分析比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.031)。可見mTOR和HBx還與預后密切相關(guān)。

綜上所述，我們可以發(fā)現(xiàn)mTOR、HBx蛋白相互作用共同參與了乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生與發(fā)展，且與患者預后有關(guān)，為肝癌的治療提供了新的靶點。但其具體機制尚待今后細胞學及動物模型實驗進一步研究證實。