mir-335-5p在肺癌骨轉移中的變化及意義①

王 明，張家瑋，于 濤,魏 巍

(1．佳木斯大學附屬第一醫院骨外二科，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯市腫瘤結核醫院乳腺外科，黑龍江 佳木斯 154007)

骨轉移癌是指原發性惡性腫瘤向骨轉移引起的骨破壞。晚期癌癥的骨轉移率一般在80%以上。癌細胞向骨轉移時，常出現與運動系統、血液系統、內分泌系統有關的癥狀，如骨痛、病理性骨折等，將大大縮短骨轉移患者的生存率。當前，確診癌癥是否骨轉移的常規辦法有：腫瘤標志物檢查、放射線、核素骨掃描、磁共振等，但當上述檢查出現改變時，往往意味著骨質已經破壞，同時敏感度與特異度較差，組織活檢為金標準但取材困難，為有創檢查，易造成腫瘤進一步擴散。由于確診較晚，即使通過藥物、射線、手術等相關治療，預后仍然很差。近年來，miRNA被發現在人類生命活動中有著不可替代的作用，同時也是腫瘤增值、侵襲、轉移的橋梁，本文旨在探討mir-335-5p在外周血中的表達與肺癌及其骨轉移的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2019-10～2020-01佳木斯市腫瘤結核醫院收治的30例肺癌患者血樣。骨轉移組15例，平均年齡(59.33±11.61)歲，納入標準：①均經過病理切片確診；②均通過PET-CT或ECT確診為骨轉移。排除標準：①患有其他原發腫瘤；②患者本人不同意參加實驗。原位癌組15例，平均年齡(62.33±12.58)歲，納入標準：均經過病理切片確診；排除標準：①患有其他原發腫瘤；②患者本人不同意參加實驗。以及12例正常人血液樣本。實驗經我院倫理委員會批準，患者知情同意，兩組受試者年齡無顯著性差異。

1.2 全血mir-335-5p的檢測

1.2.1 標本采集

采用含6%乙二胺四乙酸的一次性BD-Vacutainer1管靜脈輸注采集所有患者外周血樣2mL。于抗凝管內混勻后將樣本分為4份各250μL置于4個1.5mL無RNA酶離心管內，將分裝后樣本標記并置于-80℃低溫保存。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測miRNA-335-5P

Trizol法提取外周血中的miRNA，使用生工mirna反轉錄試劑盒(加尾法)將mirna合成cDNA。反應溫度為：37°作用60min；85°作用5min。Q-PCR反應體系與程序按生工熒光定量PCR試劑盒(染料法)說明書推薦進行。mir-335-5p引物序列為：上游引物：5’-CGCGCTCAAGAGCAATAACGAAAAATG-3’,下游引物：為反轉錄試劑盒中下游通用引物(Universal PCR Primer R(10μL))。U6內參引物為反轉錄試劑盒中U6(Universal U6 Primer F(10μL))和下游通用引物(Universal PCR Primer R(10μL))。反應體系：2Xmirna qPCR master mix 10μL；上下游引物各0.5μL；cDNA 2μL；ROX Reference Dye(H)1μL；RNase-free water 6μL；應用7300 real time PCR進行檢測。反應條件為：95°30s；(95°5s +60°30s)進行40個循環；溶解曲線以7300 real time PCR儀推薦的程序自動設定。每份樣本均在同等條件下進行mir-335-5p的檢測，每個樣本進行2次重復。濃度相對水平進行對數( 2^-△△CT) 處理后，計算 miR - 335 - 5p 基因的起始模板量從而反映出mir-335-5p基因的濃度相對水平。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 外周血中miRNA-335-5p在正常人、肺癌原位癌、肺癌骨轉移患者中的表達水平

骨轉移組對數變化(0.69±0.17)較原發性肺癌組對數變化(0.42±0.19)減少，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 正常對照組、原位癌組、骨轉移組之間的差異表達

2.2 ROC水平曲線分析

ROC曲線顯示mir-335-5p能夠明顯的區分肺癌原位癌和骨轉移癌。見圖2。ROC曲線下面積AUC為：0.838,95%置信區間為(0.689～0.985)(P<0.01)。

圖2 ROC水平曲線

2.3 mir-335-5p于肺癌骨轉移患者臨床相關性

mir-335-5p的表達在肺癌患者年齡(>60歲；≤60歲)，差異有統計學意義(P<0.05)；與患者化療前和化療后，差異有統計學意義(P<0.05)。與骨轉移發生與否，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 mir-335-5p臨床特性的統計學意義

3 討論

MicroRNA是一類僅有21-25個核苷酸的小非編碼RNA家族，它通過與靶mRNA的互補位點配對，抑制信使RNA(mRNA)的翻譯，促進mRNA的降解[1]。MicroRNA與人類多種惡性腫瘤的生物學行為密切相關，在這些惡性腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移中起著關鍵的調控作用[2]。目前在肺癌及其骨轉移中，以miRNA作為其診斷標志物的研究越來越廣泛。肺癌骨轉移中有兩種類型的miRNA改變，上調的有：miR-660-5p、mir-203、mir-125b-5p、mir-125b-2-3p等。下調的有：miR-192-5p、mir-335-5p、miR-139-5p、mir-29c、mir-21-3p等。MiRNA-335-5p屬于下調中的一員。mir-335-5p已被發現在多種惡性腫瘤中表達異常，例如：TGF-β1通過下調mir-335-5p的表達誘導NSCLC轉移[3];在結直腸癌中，mir-335-5p可通過下調IDHB抑制細胞增殖、遷移和侵襲[4];MiR-335通過上調CRKL抑制膀胱癌細胞的增殖和遷移[5]；在骨肉瘤中DNACR可以通過miR-335-5p促進腫瘤生長的和肺轉移[6]。除上述幾種惡性腫瘤外，尚有多種惡性腫瘤與mir-335-5p的侵襲和轉移密切相關，包括前列腺癌，子宮內膜癌、乳腺癌等。

目前，mir-335-5p在肺癌骨轉移相關的研究較少。mir-335-5p在NSCLC中的表達顯著降低。在體外，恢復mir-335-5p的表達可以削弱NSCLC的侵襲能力[7],隨著疾病的發展，mir-335-5p 的表達持續下降，預后不良，總生存率降低；Mir-335-5p 在小細胞癌骨轉移瘤患者中的表達明顯下調。重建 mir-335-5p 的表達可顯著抑制小細胞癌轉移。

已有多項研究表明在肺癌中，組織(腫瘤組織、骨轉移組織)、細胞(原位癌細胞、高轉移細胞)、生物學預測都已證明，相比于正常人mir-335-5p的表達明顯下調，并且隨著腫瘤進一步發展直至發展到最終的骨轉移，mir-335-5p會進一步降低。本實驗結果表明mir-335-5p的表達水平的顯著下調與肺癌從正常人到原位癌再到骨轉移的疾病進展方向一致，mir-335-5p的表達在肺癌患者年齡差異有統計學意義；肺癌中mir-335-5p的表達在外周血、組織、細胞三者均隨著疾病進展持續下降。mir-335-5p表達下調的機制需要進一步研究。

綜上所述，Mir-335-5p可作為肺癌診斷和治療及肺癌骨轉移的研究熱點，但本實驗樣本量小，mir-335-5p在肺癌進展為骨轉移的進程中的潛在作用及其作為生物標志物的臨床實用性有待進一步研究。