氧化應激對hKCFs抗氧化酶、炎性因子和基質重塑相關蛋白基因表達的影響

宋一菲，李曉娜，王思佳，賀 瑞，楊繼忠，吳婷婷

(1.太原理工大學 生物醫學工程學院，太原 030024；2.山西省眼科醫院 a.準分子激光室，b.角膜病科，太原 030002； 3.山西醫科大學附屬晉中醫院 口腔科，山西 晉中 030600)

圓錐角膜(keratoconus，KC)是一種進行性角膜變薄疾病，可引起不規則散光和視力下降，由遺傳因素[1]和環境因素(如揉眼、佩帶角膜接觸鏡、紫外線損傷等)[2]多種因素共同造成。

角膜基質組織更新代謝的速率較慢，由于長期暴露在紫外線下，容易受到自由基和活性氧的破壞，引起氧化應激水平的升高[3]。研究發現圓錐角膜患者離體角膜中含有過氧亞硝酸鹽和丙二醛的生化標記物，導致一氧化氮和脂質過氧化的形成[4]。TOPRAK et al[5]發現，與正常受試者相比，圓錐角膜患者血清總氧化水平及氧化應激指標顯著升高。氧化應激導致圓錐角膜組織退化[6]、基質變薄和鮑曼層缺失[7]。此外，超氧化物歧化酶-2(superoxide dismutase-2，SOD-2)、抗氧化酶血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)和 NADPH氧化還原酶(NADPH quinine oxidoreductase-1，NQO-1)3種常見的抗氧化酶，是氧化應激反應中的關鍵指標，先前的研究發現，正常人和圓錐角膜患者細胞中SOD-2、HO-1和NQO-1的表達不同[8]。

氧化應激可引起炎癥，促進炎性因子的釋放，參與動脈粥樣硬化和肺損傷等疾病的發生發展[9-10]。研究發現圓錐角膜患者淚液中存在腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、白介素(interleukin，IL)-1/-4/-5/-6/-8/-17等炎性因子，表明圓錐角膜的發生發展與慢性炎癥密切相關[11-12]。組織損傷后，適當的炎癥反應能夠促進組織修復，但炎性因子多度或長期存在則會導致細胞凋亡、壞死和纖維化，最終造成組織結構破壞和功能衰退[13]。目前圓錐角膜中的炎性因子的來源尚不清楚。

本文通過對圓錐角膜患者角膜成纖維細胞添加過氧化氫，探討了氧化應激對HO-1、SOD-2、NQO-1、炎性因子(ICAM-1、IL-1β/-6/-8)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1/-3、Ⅰ型膠原-α2(Collagen Ⅰ-α2)、基質金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)-1/-2/-3、賴氨酰氧化酶樣蛋白(lysyl oxidase like，LOXL)-1/-3/-4基因表達的影響，以及氧化應激在圓錐角膜發病中的作用，這將有助于更好地理解圓錐角膜發病機制，為臨床圓錐角膜的診治提供參考。

1 實驗材料和方法

1.1 主要試劑

成纖維細胞培養基(Gibico，美國)、胰蛋白酶(Gibico，美國)、Ⅱ型膠原酶(Sigma，美國)、過氧化氫(上海碧云天)、TRIZOL及 Prime-ScriptTMRT reagent Kit 檢測試劑(Takara，大連)、2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(Sigma，美國)。

1.2 人角膜成纖維細胞的提取及培養

兩例圓錐角膜患者角膜組織取自山西省眼科醫院，均為角膜移植術后廢棄的病理組織。機械剝離角膜上皮和內皮層，磷酸緩沖鹽溶液反復清洗后，用含 1 mg/mL Ⅱ型膠原酶的培養基消化，直至組織塊完全消失，鏡下可見單個細胞時終止消化。2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入成纖維細胞培養基(含體積分數為2%胎牛血清、1%體積分數為青/鏈霉素、1%體積分數為成纖維細胞生長因子)，并置于37 ℃、體積分數5% CO2孵箱內培養，本實驗采用2～4代的細胞。

1.3 過氧化氫處理

采用濃度為100 μmol/L過氧化氫處理細胞4 h，以未做任何處理的細胞作為對照。處理結束后，磷酸緩沖鹽溶液清洗，分別用TRIZOL裂解細胞，收集RNA.

1.4 熒光實時定量PCR檢測抗氧化酶基因表達

收集細胞裂解液，提取總RNA，使用Prime-ScriptTMRT reagent Kit試劑盒進行反轉錄獲得cDNA.采用熒光實時定量PCR(StepOne Plus，ABI，美國)檢測SOD-2、HO-1、NQO-1、IL-1β/-6/-8、ICAM-1、MMP-1/-3、TIMP-1/-2/-3、Collagen I -α2、 LOXL-1/-3/-4 mRNA表達，并以管家基因GAPDH作為內參。人目標基因引物序列見表1.PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s，1個循環；95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，35個循環。采用2-ΔΔCT法對基因表達進行相對定量分析。

表1 人目標基因引物序列Table 1 Human target gene primer sequence

1.5 數據統計分析

實驗結果以均值±標準差表示，采用SPSS 20.0統計分析軟件進行統計學分析，兩組間比較采用t檢驗分析。P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 氧化應激對角膜成纖維細胞抗氧化酶基因表達的影響

氧化應激可顯著上調KC細胞中抗氧化酶基因表達，如圖1所示，與未處理組相比，氧化應激條件下KC1和KC2細胞HO-1基因表達水平均升高，相對表達量分別是對照組的2.1和1.88倍(P<0.05)；NQO-1基因表達水平也均升高，KC1和KC2細胞中NQO-1相對表達量分別是對照組的1.37和1.32倍(P<0.05)；SOD-2基因表達與前兩者相似，分別是對照組的1.86和1.92倍(P<0.05).

*P<0.05，與各自對照組比較圖1 過氧化氫對圓錐角膜成纖維細胞抗氧化酶基因表達的影響Fig.1 Effects of H2O2 on the gene expression of antioxidant enzymes in hKCFs

2.2 氧化應激對角膜成纖維細胞炎性因子基因表達的影響

如圖2所示，與未處理組相比，氧化應激使KC1和KC2細胞中IL-1β基因表達顯著升高，分別為對照組的16.57和7.56倍(均P<0.05)；IL-6、IL-8基因表達與IL-1β類似，IL-6表達分別為對照組的7.51和3.34倍(均P<0.05)；IL-8表達分別為對照組的3.72和1.45倍(均P<0.05)；ICAM-1基因表達不同，KC1細胞ICAM-1基因表達為對照組的1.83倍(均P<0.05)，KC2細胞則無顯著變化(P>0.05).

2.3 氧化應激對圓錐角膜成纖維細胞MMPs和TIMPs基因表達的影響

如圖3所示，氧化應激條件下，KC1和KC2細胞MMP3基因表達均高于對照組，分別為對照組的1.86和1.92倍(均P<0.05)；KC1細胞MMP-1基因表達高于對照組細胞，為對照組的1.32倍(P<0.05)；而KC2細胞無顯著變化(P>0.05)；MMP-2基因表達二者均無顯著變化。

*表示P<0.05，與各自對照組比較圖2 過氧化氫對圓錐角膜成纖維細胞炎性因子基因表達的影響Fig.2 Effects of H2O2 on the gene expression of inflammatory cytokines in hKCFs

氧化應激使KC1、KC2細胞TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3基因表達均顯著下調。與各自的空白對照組比較，TIMP-1分別降低了14%和15%(均P<0.05)；TIMP-2分別降低了12%(P<0.05)和6%(P>0.05)；TIMP-3分別降低了33%和11%(均P<0.05).

2.4 氧化應激對角膜成纖維細胞Collagen Ⅰ和LOXLs基因表達的影響

如圖4所示，與未處理組相比，氧化應激使KC1和KC2細胞CollagenⅠ-α2基因表達均下調，與對照組相比，分別降低了10%和26%(均P<0.05)；LOXL-4和LOXL-1表達與CollagenⅠ-α2相似，與對照組相比，LOXL-1分別降低了43%和16%(均P<0.05)，LOXL-4分別降低了47%和33%(均P<0.05)；LOXL-3表達略有不同，KC1細胞下降了14%(P<0.05)，而KC2細胞上調了11%(P>0.05).

3 討論

氧化應激和抗氧化的平衡調節是抵御多種疾病和人體進行自我保護的重要途徑，參與內環境穩態以及維持人體正常生理功能的調節。研究發現圓錐角膜患者角膜細胞、角膜組織甚至整個機體內ROS水平均偏高，導致角膜處于氧化應激狀態[4-7]。目前氧化應激在圓錐角膜中的作用尚不清楚。本文主要探索了氧化應激對圓錐角膜成纖維細胞、炎性因子及基質重塑相關基因表達的影響。

當機體持續產生自由基時，抗氧化酶促防御系統被激活，通過降低活性氧水平，維持體內氧化與抗氧化動態平衡，從而防止細胞發生氧化損傷[14]。關于圓錐角膜細胞抗氧化酶表達的報道并不一致。邊江等[15]研究發現，圓錐角膜成纖維細胞中抗氧化酶SOD2、HO-1、NQO-1的表達較正常人顯著下降，過氧化氫處理后表達量未見明顯變化；筆者前期研究發現，與正常人相比，部分圓錐角膜成纖維細胞的HO-1和NQO-1顯著降低，而部分圓錐角膜成纖維細胞HO-1和SOD2則顯著增高，機械牽拉可引起ROS升高，但不同圓錐角膜患者抗氧化酶表達不同[8]。ATILANO et al[16]發現圓錐角膜成纖維細胞SOD1表達下降，而SOD2表達上升。本文研究發現過氧化氫可使圓錐角膜成纖維細胞SOD2、HO-1和NQO-1表達均增加。說明部分圓錐角膜患者發病與抗氧化系統活化缺陷有關，而部分患者抗氧化酶系統工作正常，但ROS/RNS清除機制障礙，亦可引起細胞損傷。報道的結果差異與患者病程和病因不同以及樣本量有關，同時也提示了圓錐角膜發病機制的多樣性和復雜性。

*表示P<0.05，與各自對照組比較圖3 過氧化氫對圓錐角膜成纖維細胞MMPs和TIMPs基因表達的影響Fig.3 Effects of H2O2 on the gene expression of MMPs and TIMPs in hKCFs

*表示P<0.05，與各自對照組比較圖4 過氧化氫對圓錐角膜成纖維細胞Collagen Ⅰ和LOXLs基因表達的影響Fig.4 Effects of H2O2 on the gene expression of Collagen Ⅰ and LOXLs in hKCFs

研究顯示圓錐角膜患者淚液和角膜細胞和組織中的IL-1/-6/-8、TNF-α、ICAM-1等炎癥相關因子表達明顯高于正常人，提示圓錐角膜與慢性炎癥密切相關[17]。本文研究發現，過氧化氫處理后圓錐角膜成纖維細胞炎性因子IL-1β/-6/-8和ICAM-1基因表達顯著上調。在氧化應激狀態下角膜上皮細胞也會釋放IL-6[7].提示氧化應激可能是圓錐角膜炎性因子高表達的重要來源。

氧化應激導致組織降解。氧化應激可通過上調MMP-1、MMP-2、MMP-3及MMP-7的表達，參與皮膚損傷及結直腸癌等疾病的發展[18-19]，還可以通過調節MMPs/TIMPs參與動脈粥樣硬化過程[20]。本研究發現，氧化應激可顯著上調圓錐角膜成纖維細胞中MMP-1/-3的表達，同時下調TIMP-1/-2/-3的表達。BROWN et al[6]發現過亞硝酸鹽或一氧化氮可降低人角膜成纖維細胞TIMP-1同時增加明膠酶活性，提示氧化應激與角膜組織之間降解存在一定關聯。前期研究發現，TNF-α和IL-6可促進圓錐角膜成纖維細胞MMP-1的表達，IL-6抗體可明顯抑制TNF-α誘導的MMP-1升高[21]；抑制IL-1可下調MMP-1/-3/-13表達，促進軟骨修復[22]。說明炎性因子通過干擾基質金屬蛋白酶與其抑制因子表達之間的平衡，參與了組織損傷修復和疾病病理過程。

Ⅰ型膠原是構成角膜基質的主要膠原蛋白，可通過LOXs交聯形成穩定的網狀結構，增強角膜組織力學特性和抗蛋白水解酶降解能力。前期研究發現，圓錐角膜患者角膜成纖維細胞中LOX和LOXLs基因表達均明顯低于正常人[23]。本研究發現氧化應激可顯著降低圓錐角膜細胞Collagen Ⅰ-α2、LOXL-1/-3/-4的表達，這將導致角膜組織結構穩定性下降。

本研究也存在一定的局限性。由于圓錐角膜發病的復雜性導致患者個體差異較大，大樣本量可使研究結果更具參考價值，因此本文結果的解釋還需謹慎。

綜上所述，本研究發現氧化應激狀態下，圓錐角膜成纖維細胞炎性因子表達增加，促進了MMPs與TIMPs表達失衡，LOXLs表達降低，導致Ⅰ型膠原降解增加，交聯障礙。這不僅破壞了角膜結構的穩定性，而且使角膜組織抵抗非特異性蛋白水解酶能力下降，進而導致力學性能下降，加速角膜擴張。因此，避免圓錐角膜處于氧化應激狀態，有效控制炎性因子的釋放，有望減緩圓錐角膜的發展進程。