利用流式細胞術鑒定軟棗獼猴桃倍性的方法

劉振盼

(遼寧省經濟林研究所，遼寧 大連 116031)

軟棗獼猴桃Actinidiaarguta為獼猴桃科獼猴桃屬多年生木質藤本植物[1]，其果實具有開胃健脾、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理功效[2]，被譽為“水果之王”[3]。該屬植物種類較多且倍性變異復雜，存在二倍體、四倍體、六倍體、八倍體以及非整倍體等倍性不同的系列，染色體小且倍性變異豐富[4]。在育種實踐中，不當的倍性親本選配可能會造成雜交失敗、后代不育等后果。因此，進行倍性鑒定不僅是開展獼猴桃常規育種親本選擇前提條件之一，也對其倍性育種等現代育種技術的開展具有重要意義。目前，多倍體鑒定常用的方法有兩種：一種是染色體計數法，另一種是流式細胞術(flow cytometry，FCM)。與計數法相比，流式細胞技術雖然起步較晚，但因其高效快速、制樣簡單、試材用量少且數據重復性高等優勢，成為目前最常用的植物基因組大小[5-8]或者植物倍性研究[9-10]的方法。本研究通過流式細胞儀對軟棗獼猴桃進行倍性鑒定，以期建立一套高效的軟棗獼猴桃倍性鑒定技術，為后續的倍性育種和常規雜交育種等工作提供保障。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料均采自遼寧省經濟林研究所松木島科研基地軟棗獼猴桃資源圃。2020年4月中旬在設施棚內用剪刀剪取新抽出未展開的葉片，放入冰盒帶回實驗室，用預冷的清水洗去葉片表面的灰塵，然后用吸水紙擦干凈備用。供試植株樹齡4 a，每個品種采集5個葉片。倍性分析參照品種為‘紅陽’(2n=58)，測試樣品為‘魁綠’、‘桓優1號’、‘安娜’、‘紫色薩瓦多’及自選雄株。

1.2 試驗方法

取新鮮待測樣本0.5 cm2，置于培養皿中。取Sysmex Partec CyStain UV Precise P 裂解液400 μL 加于樣本周圍，用鋒利刀片將其切碎，以充分提取出完整的細胞核，提取時間60 s。將培養皿中的液體用50 μm濾網過濾至樣品管中。向樣品管中加入Sysmex Partec CyStain UV Precise P 染液1 600 μL，染色60 s后上機測試。

待測樣品的倍性值估算方法：待測樣品的倍性值(ploidy value)=參照樣品的倍性×(待測樣品 G0/G1峰的熒光均值/參照樣品 G0/G1峰的熒光均值)。

2 結果與分析

本研究利用流式細胞儀對6個獼猴桃品種的染色體倍性進行了鑒定，結果見圖1。二倍體‘紅陽’G1其峰值在橫坐標的位置是197.86 (圖1-A)，以此為對照進行其他樣品的染色體倍性分析，根據DNA含量相對比例情況，從表1結果顯示：‘魁綠’其峰值橫坐標位置是396.89，與對照品種的比值為2.01，判斷其為四倍體(圖1-B)；同理，‘桓優1號’的峰值橫坐標位置為392.16，與對照品種的比值為1.99，判斷其為四倍體(圖1-C)；‘安娜’的峰值橫坐標位置為394.65，與對照品種的比值為1.99，判斷其為四倍體(圖1-D)；‘紫色薩瓦多’的峰值橫坐標位置為395.57，與對照品種的比值為2.00，判斷其為四倍體(圖1-E)；自選雄株的峰值橫坐標位置為585.62，與對照品種的比值為2.96，判斷其為六倍體(圖1-F)。可見，通過本試驗的方法，獲得主峰清晰、雜峰少，可以快速判斷材料的倍性。

表1 不同倍性獼猴桃屬植物細胞核DNA相對含量

圖1 流式細胞技術鑒定獼猴桃品種的相對DNA含量

注：A為‘紅陽’；B為‘魁綠’；C為‘桓優1號’；D為‘安娜’；E為‘紫色薩瓦多’；F為自選雄株。單個熒光峰代表品種細胞核數量的相對熒光強度。

3 討 論

自1997年開始，國內陸續開展了獼猴桃屬植物倍性鑒定工作[11-16]。前人研究表明，在獼猴桃屬內，軟棗獼猴桃是倍性最為復雜的物種之一，存在2X、4X、6X、7X、8X等多種倍性水平，目前發現的物種以4X居多，6X較為少見[16]。由于軟棗獼猴桃倍性復雜，染色體量基數較大，給采用傳統的壓片法進行其倍性鑒定帶來了困難。因此，建立準確、高效的倍性鑒定技術十分必要。本方法通過采集軟棗獼猴桃的組培苗幼嫩葉片進行倍性鑒定，建立了一套利用流式細胞儀進行軟棗獼猴桃倍性鑒定方法，該方法主峰清晰、雜峰少，適用于軟棗獼猴桃倍性的快速鑒定。

隨著軟棗獼猴桃產業的不斷發展，種質創新越來越重要。雖然我國目前自主培育的軟棗獼猴桃品種較少，但我國擁有豐富的獼猴桃屬資源。這些資源不僅具有較強的商品特性(豐產、味美等)，而且具有較強的抗寒性，今后可通過雜交育種手段將其與國外優良品種資源進行雜交，也可通過多倍體誘導或融合等現代生物技術實現親本間的優勢互補，開發出適宜不同生長環境的優良軟棗獼猴桃新品種。采用流式細胞術鑒定軟棗獼猴桃組培苗倍性，將為后續的倍性研究提供技術支撐。相對于傳統壓片法，流式細胞法具有樣品用量少、準確性高等優點，是一種更為高效的鑒定染色體倍性的方法。