蛋白組學技術在膿毒癥標志物研究中的應用進展

劉 欣，陳 琛，李 萌

(1.浙江中醫藥大學 第二臨床醫學院，浙江 杭州 310053；2.浙江醫院 醫學檢驗科，浙江 杭州 310013)

膿毒癥是由感染引起的失控的炎癥反應所導致的器官功能障礙[1]，是重癥監護病房(intensive care unit，ICU)患者死亡的常見原因。全球膿毒癥的流行情況仍難以控制[2]，早期識別、規范治療及抗生素早期應用能降低膿毒癥的病死率[3-4]。目前，臨床主要通過生命體征、血流動力學指標、組織灌注情況等臨床表現，乳酸、降鈣素原(procalcitonin，PCT)和G實驗/GM實驗等實驗室指標對膿毒癥的診斷、病程監測及預后進行綜合判斷；同時，通過序貫器官衰竭評分(sequential organ failure assessment，SOFA)、快速序貫器官衰竭評分(quick sequential organ failure assessment，qSOFA)、急性生理學與慢性健康狀況評分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ)、治療干預評分系統(therapeuticintervention scoring system，TISS)、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)、Logistic器官功能障礙評分(Logistic organ dysfunction system， LODS)等評分系統判斷膿毒癥的嚴重程度。由于膿毒癥疾病的異質性和診斷標準判讀的復雜性，現有的指標在臨床實際應用中仍具有較大挑戰，近年來基于質譜的蛋白組學技術已應用于膿毒癥生物學標志物的篩選及建立中。

1 膿毒癥與基于質譜的蛋白組學技術

膿毒癥患者體內發生的血流動力學改變、炎癥因子風暴、免疫平衡失調以及其他級聯反應可引起一系列蛋白水平的改變。蛋白組學技術高通量、連續多點監測等優勢為膿毒癥的診斷、監測及機制研究提供了技術保障。基于質譜(mass spectrometry，MS)的蛋白組學技術較基于二維凝膠分離(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoretograms，2D-PAGE)的蛋白組學技術在低豐度蛋白的分離鑒定中更為敏感。2013年后對膿毒癥生物標志物的研究開始應用基于質譜的蛋白組學技術。膿毒癥蛋白組學研究中采用的質譜主要為基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)和電噴霧質譜(electrospray ionization-mass spectrometry，ESI-MS)。與質譜聯用的蛋白標記技術主要有非標定量和標記定量，臨床樣本較多采用血清、血漿、尿液等，可實現對樣本中的蛋白進行定量測定。隨著膿毒癥標志物研究的深入，開始采用靶器官相關的體液樣本來反映膿毒癥器官功能障礙，如肺泡灌洗液反映肺損傷情況[5]；直接應用組織進行蛋白組學研究，如腦組織[6]、腎皮質[7]；有學者開始探索膿毒癥組織蛋白組學與血清蛋白組學間的相關性[8-9]。通過篩選、鑒定、驗證膿毒癥患者不同狀態或時間點的差異蛋白，尋找膿毒癥診斷及預后的潛在生物學標志物。見圖1。

圖1 基于質譜的蛋白組學在膿毒癥研究中的應用Figure 1 Application of proteomics based on mass spectrometry in sepsis research

2 蛋白組學技術在膿毒癥標志物篩選中的應用

Jiao等[10]應用蛋白組學技術分析膿毒癥大鼠不同時間點的血清蛋白水平，研究表明α顆粒內多聚素1(multimerin 1)、纖維膠凝蛋白1(ficolin 1)、羧肽酶N2(carboxypeptidases N2，CPN2)、絲氨酸蛋白酶1(serine protease 1)和血小板因子4(platelet factor 4)與膿毒癥密切相關；比較存活和非存活膿毒癥大鼠在不同時間點的血清蛋白水平，Logistic回歸分析證實α顆粒內多聚素1、血小板前堿性蛋白(pro-platelet basic protein)、纖維蛋白原-α(fibrinogen-α)和纖維蛋白原-β(fibrinogen-β)是膿毒癥的預后指標。在膿毒癥小鼠模型中，Cuello等[11]通過心肌組織的蛋白組學研究發現，pentraxin 3(PTX3)以八聚體的形式累積，引起膿毒癥患者心肌功能障礙，且PTX3八聚體與膿毒癥不良預后有關，可作為膿毒癥患者并發心肌炎癥的候選標志物。

Su等[12]通過膿毒癥患者與全身炎癥反應綜合征患者的尿液蛋白組學研究，從34個差異蛋白中通過蛋白質-蛋白質相互作用網絡篩選出鈣黏蛋白1、結合珠蛋白、補體C39、α1抗胰蛋白酶和銅藍蛋白5種蛋白，與膿毒癥的診斷及預后有關。膿毒癥28天幸存者組和非幸存者組尿液蛋白組學研究篩選出與膿毒癥預后相關的7種蛋白，經鑒定尿液LAMP-1水平下降的膿毒癥患者預后較差[13]。采用iTRAQ定量蛋白組學技術篩選出192個膿毒癥血清差異表達蛋白，通過蛋白表達動力學和蛋白間相互作用的聚類分析，鑒定出膿毒癥和膿毒癥休克患者血清及淋巴細胞中波形蛋白(vimentin)水平明顯高于健康對照組；波形蛋白可調節caspase-3相關的細胞凋亡、IL-2、IL-10和干擾素-α參與的炎癥反應，提示波形蛋白有望成為膿毒癥或感染性休克診斷和預后預測的新靶點[14]。

Pierrakos等[15]對178個膿毒癥標志物的研究進展進行綜述，其中34個為膿毒癥早期診斷的標志物，但目前能應用于臨床的非常有限。采用蛋白組學技術對CytoB/FMLF處理后的中性粒細胞進行分析，有12種蛋白大量并特異分泌[16]，其中肝素結合蛋白(heparin-binding protein，HBP)已商品化，已應用于臨床膿毒癥診斷中[17]。通過選擇性反應監測(selective reaction monitoring，SRM)-LC-MS/MS篩選出的C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、血漿膽固醇酯轉移蛋白(cholesterol ester transfer protein，CETP)和載脂蛋白A4(apolipoprotein A4，ApoA4)，對新生兒晚發性膿毒癥診斷的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.98(95%CI為0.917～1.000)[18]，具有較好的診斷效能。蛋白組學技術的發展為膿毒癥標志物的篩選提供了技術平臺和發展前景。

3 蛋白組學技術在膿毒癥機制研究中的應用

膿毒癥作為一種復雜疾病，被稱為“醫學上最古老和最難以捉摸的綜合征之一”[19]。危重患者的高度異質性給膿毒癥的診斷和治療帶來不確定性。

膿毒癥的發病率和死亡率隨著年齡的增長而增加，尤其在65歲后。年齡作為風險因素的分子機制尚不完全清楚[20]。一項2 320名社區獲得性肺炎患者多中心觀察隊列研究分別對50～65歲和70～85歲的膿毒癥和非膿毒癥患者進行血清蛋白組學分析，結果顯示急性期反應、凝血途徑和脂質代謝途徑的蛋白質參與了老年膿毒癥的發生發展；其中70～85歲的膿毒癥患者CRP和纖維蛋白原α鏈水平顯著降低，載脂蛋白CⅢ(apolipoprotein CⅢ，Apo CⅢ)水平顯著升高，而這些指標在50～65歲的膿毒癥患者中呈現相反的表達趨勢[21]。這3種蛋白為老年人膿毒癥高發病率提供了一定解釋，為開發針對年齡和個性化的膿毒癥治療方案提供了思路。

氫氣作為一種選擇性抗氧化劑，吸入2%氫氣對膿毒癥有保護作用，但具體機制尚未完全闡明[22]。蛋白組學研究結果顯示，氫氣通過下調腦組織中母親DPP同源物4(mothers against decapentaplegic homolog 4，SMAD4)、二氫嘧啶酶(dihydropyrimidase，DPYS)、前列腺素D2合酶蛋白表達水平，上調CUL4A表達水平，可降低膿毒癥小鼠的膿毒癥腦病的發生[6]；氫氣通過下調信號素7A(semaphorin-7A，Sema7A)、泛素硫酯酶(ubiquitin thioesterase，OTULIN)和促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1，MAP3K1)表達，上調轉鐵蛋白表達，可減輕膿毒癥小鼠的急性肺損傷[5]。

膿毒癥確診后，盡早應用抗生素仍是目前有效的治療策略[23]。但抗生素不能直接清除細菌內毒素，而體內的內毒素能刺激免疫反應、誘導炎癥反應、誘導細胞凋亡和激活凝血途徑，進而加速器官損傷[19]。機體對內毒素的臨床反應輕重不一，小劑量的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或類似物質刺激機體或單核巨噬細胞系統后，部分膿毒癥患者對致死劑量內毒素表現為低反應性或無反應性的內毒素耐受(endotoxin tolerance)。膿毒癥患者內毒素耐受的機制一直備受關注，但尚未闡明。采用相對和絕對定量蛋白組學技術分析小鼠巨噬細胞，結果顯示內毒素耐受組高遷移率族蛋白A1(high mobility group protein A1，HMGA1)和高遷移率族蛋白A2(high mobility group protein A2，HMGA2)的表達均高于膿毒癥組，而高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)和高遷移率族蛋白B2(high mobility group protein B2，HMGB2)的表達降低[24]。這些蛋白質為膿毒癥器官保護的機制研究提供了實驗基礎。

Hohn等[8]利用功能網絡分析和層次聚類分析相結合的方法將膿毒癥大鼠不同組織蛋白組學(心臟、腦、肝臟、腎臟等)研究結果與血清蛋白組學研究結果進行比較，發現無論是組織還是血清中的蛋白水平均呈高度動態變化；組織中，差異蛋白功能以氧化還原活性、細胞能量生成或代謝為主；血清中，差異蛋白功能與脂蛋白代謝、凝血功能、炎癥反應和器官再生有關；但未能找到血清與組織中功能相關的蛋白。但Malmstr?m 等[9]的研究結果顯示，同批次正常小鼠血漿、白細胞及各組織表達的所有蛋白可聚類成9組，血漿和組織分別表達不同的蛋白聚類組，比如血漿中主要表達補體及凝血系統中的蛋白(cluster Ⅰ)；血漿和組織中均表達cluster Ⅱ，包括蛋白酶抑制劑、細胞間黏附蛋白和宿主防御系統蛋白；cluster Ⅲ蛋白主要存在于組織和細胞中，但在血漿中難檢測到；cluster Ⅳ～cluster Ⅸ為各組織特異蛋白。值得注意的是，在膿毒癥小鼠血漿中有組織特異性蛋白表達增加，提示在血液中有望篩選出組織特異性的標志物，為膿毒癥血清/血漿標志物的進一步研究提供更為清晰的思路，也凸顯出生物信息學方法在膿毒癥蛋白組學數據挖掘中的重要性。

4 基于蛋白組學技術篩選膿毒癥標志物的發展前景

4.1 膿毒癥蛋白組學的新發展 根據蛋白來源或組分特點，目前蛋白組學又可細分為分泌蛋白組學、外泌體蛋白組學、糖蛋白組學及磷酸化蛋白組學[25]等。同時，蛋白組學與代謝組學[26]等多組學聯合分析，也對膿毒癥這種復雜疾病有了更清晰的認識。

分泌蛋白參與細胞信號轉導、增殖、凋亡等生命過程，分泌蛋白組(secretome)是通過蛋白組學方法對組織或細胞等分泌到胞外的蛋白進行分析，為組織、細胞與血清找到相關聯的標志物提供了線索。膿毒癥患者內皮細胞暴露于生物刺激因子和物理應激下，內皮細胞活躍分泌的蛋白質在膿毒癥引發的炎癥反應中發揮關鍵作用[27]，這為內皮細胞在膿毒癥中增加血管炎癥和凝血作用的機制研究提供了線索。膿毒癥患者儲存在中性粒細胞顆粒中的蛋白質釋放，通過比較中性粒細胞內與分泌的蛋白，可以觀察到中性粒細胞攜帶的蛋白質在膿毒癥患者的血液循環中顯著增加[16]。

Wang等[28]通過相對和絕對定量蛋白組學方法分析了LPS誘導的膿毒癥中巨噬細胞來源的外泌體中的蛋白組成。在巨噬細胞-外泌體中共鑒定出5 056個蛋白，341個蛋白表達增加，363個蛋白表達減少。肝細胞可以攝取巨噬細胞-外泌體，隨后NOD樣受體含熱蛋白結構域蛋白3(NOD-like receptor, pyrin domain containing protein protein 3，NLRP3)炎性小體被激活，提示巨噬細胞外泌體在膿毒癥肝損傷中的重要性。

蛋白質的翻譯后修飾使許多蛋白具有生物學活性，其中糖基化是重要的修飾方式之一。糖基化蛋白在免疫應答、細胞生長、炎癥的產生等方面有著重要作用。血漿糖蛋白組學研究[29]發現，在膿毒癥死亡者中，內源性凝血途徑中抗凝血酶-Ⅲ和補體因子VⅢ蛋白上調；在膿毒癥存活者中，外源性凝血途徑的組織因子抑制物和補體因子V增加。因此，凝血途徑的蛋白在膿毒癥幸存者和死亡者中差異表達，這與糖蛋白差異表達有關。

4.2 基于蛋白組學篩選的膿毒癥標志物臨床應用的研究方向 基于蛋白組學篩選的膿毒癥標志物研究有了較大發展，但目前能應用于臨床的蛋白標志物還非常有限，還需進一步尋找發展的突破口和方向。

首先，蛋白組學技術的飛速發展有助于篩選更為精準的膿毒癥蛋白標志物。基于納米級的“組學”富集技術的脂質納米粒(AmBisome?)濃縮平臺有可能大幅改善血漿蛋白組學分析，為蛋白標志物的研發提供更為穩定的平臺[30]。血漿樣本經17% OptiPrepTM密度梯度離心液可幫助外泌體制備，有助于外泌體蛋白組學研究[31]。頂級蛋白組學技術—慢速率修飾的蛋白適體技術(Slow-Off rate Modified Aptamer，SOMAmer)[32]也為膿毒癥的研究提供更精準的技術平臺。

其次，生物信息技術對蛋白間的相互聯系或功能分類分析讓我們在驗證、分析這些蛋白質時有了更清晰全面的認識。Pimienta等[33]聯合LFQ和TMT兩種定量蛋白組學技術對5種不同細菌感染導致膿毒癥的小鼠模型進行血漿蛋白組學研究，通過軟件分析，建立了84個蛋白的膿毒癥血漿蛋白組特征譜(plasma proteome signature of sepsis，PPSS)， 包括參與免疫抑制、血管穩態、凝血、補體、中性粒細胞功能、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)/胰島素樣生長因子1受體基因(IGF1R)軸和TAM酪氨酸激酶受體(Tyro3、Axl、MerTK)軸7個功能不同的亞網絡；結果顯示，PPSS可量化、可取代目前基于臨床癥狀診斷膿毒癥的方法。Shubin等[32]分析兒童膿毒癥和非感染引起的全身炎癥反應患者中差異表達蛋白，通過加權基因共表達網絡(weighted gene correlation network analysis，WGCNA)，界定出與膿毒癥強相關性的“棕色”蛋白模型和與膿毒癥中度相關的“藍色”蛋白模型。生物信息分析方法的應用為發現和評估新的治療策略提供技術保障，使診斷評估更具模型化、更便利。

綜上所述，從體液、組織蛋白組學研究，到內皮細胞、中性粒細胞、血小板等細胞水平蛋白組學研究；從液體、組織蛋白組學到分類更為細致的分泌蛋白組學、外泌體蛋白組學、糖蛋白組學研究；從單一蛋白組學到蛋白組與代謝組的多組學聯合研究，蛋白組學技術的發展為膿毒癥標志物的篩選及機制研究提供了更為廣闊的技術平臺。