蛋白組學(xué)技術(shù)在膿毒癥標(biāo)志物研究中的應(yīng)用進(jìn)展

劉 欣，陳 琛，李 萌

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，浙江 杭州 310013)

膿毒癥是由感染引起的失控的炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的器官功能障礙[1]，是重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)患者死亡的常見(jiàn)原因。全球膿毒癥的流行情況仍難以控制[2]，早期識(shí)別、規(guī)范治療及抗生素早期應(yīng)用能降低膿毒癥的病死率[3-4]。目前，臨床主要通過(guò)生命體征、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、組織灌注情況等臨床表現(xiàn)，乳酸、降鈣素原(procalcitonin，PCT)和G實(shí)驗(yàn)/GM實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)膿毒癥的診斷、病程監(jiān)測(cè)及預(yù)后進(jìn)行綜合判斷；同時(shí)，通過(guò)序貫器官衰竭評(píng)分(sequential organ failure assessment，SOFA)、快速序貫器官衰竭評(píng)分(quick sequential organ failure assessment，qSOFA)、急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ)、治療干預(yù)評(píng)分系統(tǒng)(therapeuticintervention scoring system，TISS)、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)、Logistic器官功能障礙評(píng)分(Logistic organ dysfunction system， LODS)等評(píng)分系統(tǒng)判斷膿毒癥的嚴(yán)重程度。由于膿毒癥疾病的異質(zhì)性和診斷標(biāo)準(zhǔn)判讀的復(fù)雜性，現(xiàn)有的指標(biāo)在臨床實(shí)際應(yīng)用中仍具有較大挑戰(zhàn)，近年來(lái)基于質(zhì)譜的蛋白組學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于膿毒癥生物學(xué)標(biāo)志物的篩選及建立中。

1 膿毒癥與基于質(zhì)譜的蛋白組學(xué)技術(shù)

膿毒癥患者體內(nèi)發(fā)生的血流動(dòng)力學(xué)改變、炎癥因子風(fēng)暴、免疫平衡失調(diào)以及其他級(jí)聯(lián)反應(yīng)可引起一系列蛋白水平的改變。蛋白組學(xué)技術(shù)高通量、連續(xù)多點(diǎn)監(jiān)測(cè)等優(yōu)勢(shì)為膿毒癥的診斷、監(jiān)測(cè)及機(jī)制研究提供了技術(shù)保障。基于質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)的蛋白組學(xué)技術(shù)較基于二維凝膠分離(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoretograms，2D-PAGE)的蛋白組學(xué)技術(shù)在低豐度蛋白的分離鑒定中更為敏感。2013年后對(duì)膿毒癥生物標(biāo)志物的研究開(kāi)始應(yīng)用基于質(zhì)譜的蛋白組學(xué)技術(shù)。膿毒癥蛋白組學(xué)研究中采用的質(zhì)譜主要為基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)和電噴霧質(zhì)譜(electrospray ionization-mass spectrometry，ESI-MS)。與質(zhì)譜聯(lián)用的蛋白標(biāo)記技術(shù)主要有非標(biāo)定量和標(biāo)記定量，臨床樣本較多采用血清、血漿、尿液等，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中的蛋白進(jìn)行定量測(cè)定。隨著膿毒癥標(biāo)志物研究的深入，開(kāi)始采用靶器官相關(guān)的體液樣本來(lái)反映膿毒癥器官功能障礙，如肺泡灌洗液反映肺損傷情況[5]；直接應(yīng)用組織進(jìn)行蛋白組學(xué)研究，如腦組織[6]、腎皮質(zhì)[7]；有學(xué)者開(kāi)始探索膿毒癥組織蛋白組學(xué)與血清蛋白組學(xué)間的相關(guān)性[8-9]。通過(guò)篩選、鑒定、驗(yàn)證膿毒癥患者不同狀態(tài)或時(shí)間點(diǎn)的差異蛋白，尋找膿毒癥診斷及預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。見(jiàn)圖1。

圖1 基于質(zhì)譜的蛋白組學(xué)在膿毒癥研究中的應(yīng)用Figure 1 Application of proteomics based on mass spectrometry in sepsis research

2 蛋白組學(xué)技術(shù)在膿毒癥標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用

Jiao等[10]應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)分析膿毒癥大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的血清蛋白水平，研究表明α顆粒內(nèi)多聚素1(multimerin 1)、纖維膠凝蛋白1(ficolin 1)、羧肽酶N2(carboxypeptidases N2，CPN2)、絲氨酸蛋白酶1(serine protease 1)和血小板因子4(platelet factor 4)與膿毒癥密切相關(guān)；比較存活和非存活膿毒癥大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的血清蛋白水平，Logistic回歸分析證實(shí)α顆粒內(nèi)多聚素1、血小板前堿性蛋白(pro-platelet basic protein)、纖維蛋白原-α(fibrinogen-α)和纖維蛋白原-β(fibrinogen-β)是膿毒癥的預(yù)后指標(biāo)。在膿毒癥小鼠模型中，Cuello等[11]通過(guò)心肌組織的蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，pentraxin 3(PTX3)以八聚體的形式累積，引起膿毒癥患者心肌功能障礙，且PTX3八聚體與膿毒癥不良預(yù)后有關(guān)，可作為膿毒癥患者并發(fā)心肌炎癥的候選標(biāo)志物。

Su等[12]通過(guò)膿毒癥患者與全身炎癥反應(yīng)綜合征患者的尿液蛋白組學(xué)研究，從34個(gè)差異蛋白中通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)篩選出鈣黏蛋白1、結(jié)合珠蛋白、補(bǔ)體C39、α1抗胰蛋白酶和銅藍(lán)蛋白5種蛋白，與膿毒癥的診斷及預(yù)后有關(guān)。膿毒癥28天幸存者組和非幸存者組尿液蛋白組學(xué)研究篩選出與膿毒癥預(yù)后相關(guān)的7種蛋白，經(jīng)鑒定尿液LAMP-1水平下降的膿毒癥患者預(yù)后較差[13]。采用iTRAQ定量蛋白組學(xué)技術(shù)篩選出192個(gè)膿毒癥血清差異表達(dá)蛋白，通過(guò)蛋白表達(dá)動(dòng)力學(xué)和蛋白間相互作用的聚類(lèi)分析，鑒定出膿毒癥和膿毒癥休克患者血清及淋巴細(xì)胞中波形蛋白(vimentin)水平明顯高于健康對(duì)照組；波形蛋白可調(diào)節(jié)caspase-3相關(guān)的細(xì)胞凋亡、IL-2、IL-10和干擾素-α參與的炎癥反應(yīng)，提示波形蛋白有望成為膿毒癥或感染性休克診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的新靶點(diǎn)[14]。

Pierrakos等[15]對(duì)178個(gè)膿毒癥標(biāo)志物的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，其中34個(gè)為膿毒癥早期診斷的標(biāo)志物，但目前能應(yīng)用于臨床的非常有限。采用蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)CytoB/FMLF處理后的中性粒細(xì)胞進(jìn)行分析，有12種蛋白大量并特異分泌[16]，其中肝素結(jié)合蛋白(heparin-binding protein，HBP)已商品化，已應(yīng)用于臨床膿毒癥診斷中[17]。通過(guò)選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)(selective reaction monitoring，SRM)-LC-MS/MS篩選出的C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(cholesterol ester transfer protein，CETP)和載脂蛋白A4(apolipoprotein A4，ApoA4)，對(duì)新生兒晚發(fā)性膿毒癥診斷的曲線(xiàn)下面積(area under curve，AUC)為0.98(95%CI為0.917～1.000)[18]，具有較好的診斷效能。蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為膿毒癥標(biāo)志物的篩選提供了技術(shù)平臺(tái)和發(fā)展前景。

3 蛋白組學(xué)技術(shù)在膿毒癥機(jī)制研究中的應(yīng)用

膿毒癥作為一種復(fù)雜疾病，被稱(chēng)為“醫(yī)學(xué)上最古老和最難以捉摸的綜合征之一”[19]。危重患者的高度異質(zhì)性給膿毒癥的診斷和治療帶來(lái)不確定性。

膿毒癥的發(fā)病率和死亡率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，尤其在65歲后。年齡作為風(fēng)險(xiǎn)因素的分子機(jī)制尚不完全清楚[20]。一項(xiàng)2 320名社區(qū)獲得性肺炎患者多中心觀察隊(duì)列研究分別對(duì)50～65歲和70～85歲的膿毒癥和非膿毒癥患者進(jìn)行血清蛋白組學(xué)分析，結(jié)果顯示急性期反應(yīng)、凝血途徑和脂質(zhì)代謝途徑的蛋白質(zhì)參與了老年膿毒癥的發(fā)生發(fā)展；其中70～85歲的膿毒癥患者CRP和纖維蛋白原α鏈水平顯著降低，載脂蛋白CⅢ(apolipoprotein CⅢ，Apo CⅢ)水平顯著升高，而這些指標(biāo)在50～65歲的膿毒癥患者中呈現(xiàn)相反的表達(dá)趨勢(shì)[21]。這3種蛋白為老年人膿毒癥高發(fā)病率提供了一定解釋?zhuān)瑸殚_(kāi)發(fā)針對(duì)年齡和個(gè)性化的膿毒癥治療方案提供了思路。

氫氣作為一種選擇性抗氧化劑，吸入2%氫氣對(duì)膿毒癥有保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚未完全闡明[22]。蛋白組學(xué)研究結(jié)果顯示，氫氣通過(guò)下調(diào)腦組織中母親DPP同源物4(mothers against decapentaplegic homolog 4，SMAD4)、二氫嘧啶酶(dihydropyrimidase，DPYS)、前列腺素D2合酶蛋白表達(dá)水平，上調(diào)CUL4A表達(dá)水平，可降低膿毒癥小鼠的膿毒癥腦病的發(fā)生[6]；氫氣通過(guò)下調(diào)信號(hào)素7A(semaphorin-7A，Sema7A)、泛素硫酯酶(ubiquitin thioesterase，OTULIN)和促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1，MAP3K1)表達(dá)，上調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)，可減輕膿毒癥小鼠的急性肺損傷[5]。

膿毒癥確診后，盡早應(yīng)用抗生素仍是目前有效的治療策略[23]。但抗生素不能直接清除細(xì)菌內(nèi)毒素，而體內(nèi)的內(nèi)毒素能刺激免疫反應(yīng)、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和激活凝血途徑，進(jìn)而加速器官損傷[19]。機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素的臨床反應(yīng)輕重不一，小劑量的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或類(lèi)似物質(zhì)刺激機(jī)體或單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)后，部分膿毒癥患者對(duì)致死劑量?jī)?nèi)毒素表現(xiàn)為低反應(yīng)性或無(wú)反應(yīng)性的內(nèi)毒素耐受(endotoxin tolerance)。膿毒癥患者內(nèi)毒素耐受的機(jī)制一直備受關(guān)注，但尚未闡明。采用相對(duì)和絕對(duì)定量蛋白組學(xué)技術(shù)分析小鼠巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示內(nèi)毒素耐受組高遷移率族蛋白A1(high mobility group protein A1，HMGA1)和高遷移率族蛋白A2(high mobility group protein A2，HMGA2)的表達(dá)均高于膿毒癥組，而高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)和高遷移率族蛋白B2(high mobility group protein B2，HMGB2)的表達(dá)降低[24]。這些蛋白質(zhì)為膿毒癥器官保護(hù)的機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Hohn等[8]利用功能網(wǎng)絡(luò)分析和層次聚類(lèi)分析相結(jié)合的方法將膿毒癥大鼠不同組織蛋白組學(xué)(心臟、腦、肝臟、腎臟等)研究結(jié)果與血清蛋白組學(xué)研究結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是組織還是血清中的蛋白水平均呈高度動(dòng)態(tài)變化；組織中，差異蛋白功能以氧化還原活性、細(xì)胞能量生成或代謝為主；血清中，差異蛋白功能與脂蛋白代謝、凝血功能、炎癥反應(yīng)和器官再生有關(guān)；但未能找到血清與組織中功能相關(guān)的蛋白。但Malmstr?m 等[9]的研究結(jié)果顯示，同批次正常小鼠血漿、白細(xì)胞及各組織表達(dá)的所有蛋白可聚類(lèi)成9組，血漿和組織分別表達(dá)不同的蛋白聚類(lèi)組，比如血漿中主要表達(dá)補(bǔ)體及凝血系統(tǒng)中的蛋白(cluster Ⅰ)；血漿和組織中均表達(dá)cluster Ⅱ，包括蛋白酶抑制劑、細(xì)胞間黏附蛋白和宿主防御系統(tǒng)蛋白；cluster Ⅲ蛋白主要存在于組織和細(xì)胞中，但在血漿中難檢測(cè)到；cluster Ⅳ～cluster Ⅸ為各組織特異蛋白。值得注意的是，在膿毒癥小鼠血漿中有組織特異性蛋白表達(dá)增加，提示在血液中有望篩選出組織特異性的標(biāo)志物，為膿毒癥血清/血漿標(biāo)志物的進(jìn)一步研究提供更為清晰的思路，也凸顯出生物信息學(xué)方法在膿毒癥蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘中的重要性。

4 基于蛋白組學(xué)技術(shù)篩選膿毒癥標(biāo)志物的發(fā)展前景

4.1 膿毒癥蛋白組學(xué)的新發(fā)展 根據(jù)蛋白來(lái)源或組分特點(diǎn)，目前蛋白組學(xué)又可細(xì)分為分泌蛋白組學(xué)、外泌體蛋白組學(xué)、糖蛋白組學(xué)及磷酸化蛋白組學(xué)[25]等。同時(shí)，蛋白組學(xué)與代謝組學(xué)[26]等多組學(xué)聯(lián)合分析，也對(duì)膿毒癥這種復(fù)雜疾病有了更清晰的認(rèn)識(shí)。

分泌蛋白參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、凋亡等生命過(guò)程，分泌蛋白組(secretome)是通過(guò)蛋白組學(xué)方法對(duì)組織或細(xì)胞等分泌到胞外的蛋白進(jìn)行分析，為組織、細(xì)胞與血清找到相關(guān)聯(lián)的標(biāo)志物提供了線(xiàn)索。膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞暴露于生物刺激因子和物理應(yīng)激下，內(nèi)皮細(xì)胞活躍分泌的蛋白質(zhì)在膿毒癥引發(fā)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27]，這為內(nèi)皮細(xì)胞在膿毒癥中增加血管炎癥和凝血作用的機(jī)制研究提供了線(xiàn)索。膿毒癥患者儲(chǔ)存在中性粒細(xì)胞顆粒中的蛋白質(zhì)釋放，通過(guò)比較中性粒細(xì)胞內(nèi)與分泌的蛋白，可以觀察到中性粒細(xì)胞攜帶的蛋白質(zhì)在膿毒癥患者的血液循環(huán)中顯著增加[16]。

Wang等[28]通過(guò)相對(duì)和絕對(duì)定量蛋白組學(xué)方法分析了LPS誘導(dǎo)的膿毒癥中巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體中的蛋白組成。在巨噬細(xì)胞-外泌體中共鑒定出5 056個(gè)蛋白，341個(gè)蛋白表達(dá)增加，363個(gè)蛋白表達(dá)減少。肝細(xì)胞可以攝取巨噬細(xì)胞-外泌體，隨后NOD樣受體含熱蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3(NOD-like receptor, pyrin domain containing protein protein 3，NLRP3)炎性小體被激活，提示巨噬細(xì)胞外泌體在膿毒癥肝損傷中的重要性。

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾使許多蛋白具有生物學(xué)活性，其中糖基化是重要的修飾方式之一。糖基化蛋白在免疫應(yīng)答、細(xì)胞生長(zhǎng)、炎癥的產(chǎn)生等方面有著重要作用。血漿糖蛋白組學(xué)研究[29]發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥死亡者中，內(nèi)源性凝血途徑中抗凝血酶-Ⅲ和補(bǔ)體因子VⅢ蛋白上調(diào)；在膿毒癥存活者中，外源性凝血途徑的組織因子抑制物和補(bǔ)體因子V增加。因此，凝血途徑的蛋白在膿毒癥幸存者和死亡者中差異表達(dá)，這與糖蛋白差異表達(dá)有關(guān)。

4.2 基于蛋白組學(xué)篩選的膿毒癥標(biāo)志物臨床應(yīng)用的研究方向 基于蛋白組學(xué)篩選的膿毒癥標(biāo)志物研究有了較大發(fā)展，但目前能應(yīng)用于臨床的蛋白標(biāo)志物還非常有限，還需進(jìn)一步尋找發(fā)展的突破口和方向。

首先，蛋白組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展有助于篩選更為精準(zhǔn)的膿毒癥蛋白標(biāo)志物。基于納米級(jí)的“組學(xué)”富集技術(shù)的脂質(zhì)納米粒(AmBisome?)濃縮平臺(tái)有可能大幅改善血漿蛋白組學(xué)分析，為蛋白標(biāo)志物的研發(fā)提供更為穩(wěn)定的平臺(tái)[30]。血漿樣本經(jīng)17% OptiPrepTM密度梯度離心液可幫助外泌體制備，有助于外泌體蛋白組學(xué)研究[31]。頂級(jí)蛋白組學(xué)技術(shù)—慢速率修飾的蛋白適體技術(shù)(Slow-Off rate Modified Aptamer，SOMAmer)[32]也為膿毒癥的研究提供更精準(zhǔn)的技術(shù)平臺(tái)。

其次，生物信息技術(shù)對(duì)蛋白間的相互聯(lián)系或功能分類(lèi)分析讓我們?cè)隍?yàn)證、分析這些蛋白質(zhì)時(shí)有了更清晰全面的認(rèn)識(shí)。Pimienta等[33]聯(lián)合LFQ和TMT兩種定量蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)5種不同細(xì)菌感染導(dǎo)致膿毒癥的小鼠模型進(jìn)行血漿蛋白組學(xué)研究，通過(guò)軟件分析，建立了84個(gè)蛋白的膿毒癥血漿蛋白組特征譜(plasma proteome signature of sepsis，PPSS)， 包括參與免疫抑制、血管穩(wěn)態(tài)、凝血、補(bǔ)體、中性粒細(xì)胞功能、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)/胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體基因(IGF1R)軸和TAM酪氨酸激酶受體(Tyro3、Axl、MerTK)軸7個(gè)功能不同的亞網(wǎng)絡(luò)；結(jié)果顯示，PPSS可量化、可取代目前基于臨床癥狀診斷膿毒癥的方法。Shubin等[32]分析兒童膿毒癥和非感染引起的全身炎癥反應(yīng)患者中差異表達(dá)蛋白，通過(guò)加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(weighted gene correlation network analysis，WGCNA)，界定出與膿毒癥強(qiáng)相關(guān)性的“棕色”蛋白模型和與膿毒癥中度相關(guān)的“藍(lán)色”蛋白模型。生物信息分析方法的應(yīng)用為發(fā)現(xiàn)和評(píng)估新的治療策略提供技術(shù)保障，使診斷評(píng)估更具模型化、更便利。

綜上所述，從體液、組織蛋白組學(xué)研究，到內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板等細(xì)胞水平蛋白組學(xué)研究；從液體、組織蛋白組學(xué)到分類(lèi)更為細(xì)致的分泌蛋白組學(xué)、外泌體蛋白組學(xué)、糖蛋白組學(xué)研究；從單一蛋白組學(xué)到蛋白組與代謝組的多組學(xué)聯(lián)合研究，蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為膿毒癥標(biāo)志物的篩選及機(jī)制研究提供了更為廣闊的技術(shù)平臺(tái)。