雌激素受體α/β基因表達與膽囊膽固醇結石形成相關性研究

杜國濤， 王 青， 趙偉偉， 張兆波， 孫 悅， 趙鵬程， 劉建中

滄州市人民醫院 1.肝膽外科；2.胃腸外科；3.檢驗科；4.超聲科，河北 滄州 061000

膽囊膽固醇結石屬于消化系統常見疾病，好發于成年女性，近年來發病率呈升高的趨勢。隨著病程延長，其有可能演變成膽囊癌及膽道系統惡性腫瘤，危及患者生命安全[1]。有研究發現，雌激素可以通過肝雌激素受體(estrogen receptor，ER)誘發膽結石形成，但是目前臨床對于ERα或ERβ基因表達與膽囊膽固醇結石形成之間的關系少見報道[2]。本研究旨在探討ERα或ERβ基因表達與膽囊膽固醇結石形成之間的關系。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2015年10月至2018年6月于滄州市人民醫院接受手術治療的60例膽囊膽固醇結石患者納入B組，另選取60例因膽囊炎或肝血管瘤需要實施手術治療的患者納入A組。納入標準：(1)膽囊結石、膽囊炎、肝血管瘤患者的診斷標準參考人民衛生出版社《外科學》第7版中的標準；(2)患者經CT、超聲及磁共振胰膽管成像檢查確診；(3)患者年齡19～79歲。排除標準：(1)肝、膽道惡性腫瘤；(2)因寄生蟲病導致的結石疾病；(3)一般資料缺失，無法進行統計；(4)長期酗酒；(5)近2個月服用調血脂藥物史。本研究經醫院倫理委員會批準。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 ERα mRNA和ERβ mRNA表達檢測方法 獲取肝組織總RNA并提取cDNA，采用美國GIBCO公司提供的Trizol試劑盒提取總RNA，在貝克曼D640U紫外分光光度計測定260 nm和280 nm下波長的A值，比值在1.6～1.8之間提示RNA純度高。在1%瓊脂糖凝膠電泳下鑒定RNA完整性，稀釋RNA 1 μg/μl，合成cDNA，在-80℃下保存，采用Primer Express軟件設計引物，上游引物序列：TCTTGGACAGGAACCAGGGA；下游引物序列：CGAGATGTAGCCAGCAGC。采用MedProbe公司提供的計算機系統開展測定，聚合酶鏈式反應產物經溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳確定特異性，反應條件：預變性95℃、15 min，變性95℃、10 s，退火59℃、20 s，進行40個循環，終末延伸72℃、32 s，結束后讀取Ct值，結果采用 2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.3 一般資料的收集及檢測 收集兩組患者的年齡、性別、體質量指數、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、瘦素、膽汁中總膽固醇及總膽汁酸含量。抽取患者空腹靜脈血3 ml，以2 000 r/min離心30 min后分離血清，采用日立7600型全自動生化分析儀對患者血脂瘦素、膽汁中總膽固醇及總膽汁酸含量進行測定，試劑盒為南京建成生物制品有限公司提供。用碳酸鹽包被緩沖液，將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10 μg/ml，在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1 ml，4℃過夜。次日用洗滌緩沖液洗3次，每次3 min。加一定稀釋的待檢樣品0.1 ml于上述已包被的反應孔中，置37℃孵育1 h。各反應孔中加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1 ml，37℃孵育0.5～1.0 h。洗滌加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1 ml，37℃ 10～30 min。于各反應孔中加入2 mol/L硫酸0.05 ml終止反應后判讀結果。

2 結果

2.1 兩組患者肝組織中ERα mRNA和ERβ mRNA表達比較 B組患者肝組織中ERα mRNA、ERβ mRNA表達強度均顯著高于A組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 兩組患者一般資料比較 B組患者血清甘油三酯、總膽固醇、瘦素、膽汁總膽固醇水平均高于A組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 多因素Logistic回歸分析結果 患者的血清甘油三酯、瘦素、膽汁總膽固醇水平增高，肝組織中ERα mRNA、ERβ mRNA表達上調是發生膽囊膽固醇結石的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表1 兩組患者肝組織中ERα mRNA、ERβ mRNA表達比較

表2 兩組患者一般資料比較

表3 Logistic回歸分析

3 討論

膽石癥屬于臨床常見的消化系統疾病，可繼發膽囊炎、膽管炎、胰腺炎，以及膽道腫瘤等多種疾患，危害患者身體健康，造成嚴重的社會經濟負擔[3-4]。肝分泌過多的膽固醇是結石形成的主要病理基礎，膽固醇過飽和導致膽固醇晶體沉淀，并最終形成肉眼可見的結石[5-6]。膽固醇結石發生和發展受到基因、環境及遺傳因素相互調控，屬于多因素決定的復雜性疾病。流行病學調查發現，種族差異和遺傳異質性在膽固醇結石發生和發展過程中具有重要的作用[7]。目前，血清甘油三酯、總膽固醇、瘦素、膽汁總膽固醇水平已被證實在促進膽固醇結石發展中具有重要的作用。膽汁酸是膽汁的主要組成成分，是膽固醇在肝中降解的代謝產物，膽汁酸不僅在膽固醇代謝及膽固醇的溶解中發揮重要作用，而且還影響食物脂類的消化、吸收。膽固醇的排泄受膽固醇與卵磷脂的相對比例的影響，當膽固醇與膽汁酸及卵磷脂的比值增高時，就會導致膽固醇過飽和，以結晶的形式析出，形成結石[8]。同時，膽結石患者體內還存在血脂紊亂，高密度脂蛋白還會參與機體膽固醇逆轉運，將機體內游離的膽固醇轉運至肝，優先用于合成膽汁酸，其參與轉運的高密度脂蛋白膽固醇是膽汁內膽固醇的主要來源，在一定條件下參與形成膽固醇結石[9-10]。

本研究分析了肝組織中ERα mRNA、ERβ mRNA的表達強度。ERα、ERβ可以發揮基因調節作用，調節下游靶基因。有研究發現，17β-雌二醇主要通過雌激素受體對靶基因轉錄調控，在膽汁膽固醇的生物合成中具有重要作用[11]。另有研究發現，膽固醇結石發病同ERα上調有關，但是與ERβ無關，考慮是由于ERα和ERβ具有不同的轉錄激活結構域及組織分布特異性相關。本研究結果顯示，膽固醇結石發生與Erβ相關，原因可能為ERβ參與了ERα高表達人群膽固醇結石發生的遺傳性[12-13]。本研究中，B組患者肝組織中的ERα mRNA、ERβ mRNA表達強度顯著高于A組，提示在膽囊膽固醇結石患者中存在ERα mRNA、ERβ mRNA表達上調；B組患者的血清甘油三酯、總膽固醇、瘦素、膽汁總膽固醇水平均高于A組，提示在膽囊膽固醇結石患者中血脂表達異常；Logistic回歸分析發現，血清甘油三酯、瘦素、膽汁總膽固醇水平增高、肝組織中ERα mRNA、ERβ mRNA表達上調是發生膽囊膽固醇結石的獨立危險因素，提示了血脂異常、肝組織中的ERα mRNA、ERβ mRNA表達升高會導致膽囊膽固醇結石高發。

綜上所述，肝組織中ERα mRNA、ERβ mRNA表達上調與膽囊膽固醇結石的形成密切相關。