RH-PBSCT治療后細(xì)胞免疫功能表達(dá)及與急性移植物抗宿主病發(fā)生關(guān)系研究

徐建麗， 袁海龍， 王洪波， 陳 剛， 楊蕊雪， 古力巴旦木·艾則孜，瑪麗婭·木哈什， 曲建華， 龐楠楠， 江 明

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 血液病中心，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)血液病研究所，新疆 烏魯木齊 830054

異基因造血干細(xì)胞移植選擇單倍體相合的供者進行單倍體相合造血干細(xì)胞移植，以提高白血病治愈率。但治療后移植物抗宿主病(graft versus host disease，aGVHD)發(fā)生率顯著增加，多通過兔抗人胸腺免疫球蛋白(anti-thymocyte，ATG)克服人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)不合，同時消耗體內(nèi)T細(xì)胞來抑制aGVHD的進展[1]。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)動員后，外周血干細(xì)胞移植中aGVHD發(fā)生率降低，該機制主要為G-CSF可從骨髓動員更多的髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)到達(dá)外周而達(dá)到免疫耐受[2-3]。本研究設(shè)計并逐步完善了親緣間HLA單倍體相合非體外去T細(xì)胞高劑量外周血造血干細(xì)胞移植(related HLA-haploidentical non T cell-depleted in vitro high dose peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation,RH-PBSCT)模式，即輸注經(jīng)G-CSF動員高劑量的非體外去T細(xì)胞外周血單個核細(xì)胞，分析治療后細(xì)胞免疫功能的變化及急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease，aGVHD)的發(fā)生率，以期為異基因造血干細(xì)胞移植提供更多的可能思路。現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2012年1月至2018年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院進行RH-PBSCT治療的98例白血病患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡<50歲；HLA配型無全相合供者(中華骨髓庫無關(guān)供者和臍帶血庫尋找相匹配的臍帶血均無或病情不能等待者)，選擇親緣間的單倍體供者；移植前無活動性感染者；移植前無明顯臟器損傷功能障礙者；預(yù)處理前供者體內(nèi)免疫相關(guān)的各項指標(biāo)(Th1及Th2型細(xì)胞因子，CD4+CD25+Treg細(xì)胞)均正常。患者年齡4～50歲，其中，年齡<40歲63例，年齡≥40歲35例；男性40例，女性58例；急性髓系白血病50例、急性淋巴細(xì)胞白血病45例，骨髓增生異常綜合征3例；標(biāo)危45例，高危53例?？煞治鯩DSCs標(biāo)本親緣單倍體相合健康供者30例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。患者均知情同意。

1.2 研究方法 供者于輸注干細(xì)胞前5 d開始應(yīng)用G-CSF 7～10 μg/kg/d，G-CSF使用后5、6 d開始使用血細(xì)胞分離機分離外周血干細(xì)胞，故于G-CSF動員前及動員后5、6 d采集供者外周血，并于動員后5、6 d收集外周血造血干細(xì)胞。若患者移植后未發(fā)生aGVHD，在移植后30、60、90 d時檢測MDSCs細(xì)胞的相對數(shù)量；若患者在移植后發(fā)生aGVHD，在發(fā)生時立即檢測，治療過程中每周動態(tài)監(jiān)測至aGVHD完全控制，aGVHD完全控制或明顯緩解后再檢測1次。aGVHD的診斷和分級參考西雅圖診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.3 觀察指標(biāo) 流式細(xì)胞術(shù)檢測G-CSF動員前后，移植后患者30、60、90 d的MDSCs細(xì)胞的相對數(shù)量變化。酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測移植后患者30、60、90 d的Th1及Th2型細(xì)胞因子[轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β， TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)]，以及CD4+CD25+Treg細(xì)胞的變化情況。

2 結(jié)果

2.1 健康供者 G-CSF動員前、后MDSCs含量比較供者動員后MDSCs含量為(3.14%±1.01%)，高于動員前的(1.66%±0.78%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.335,P<0.05)。見圖1。

2.2 aGVHD發(fā)生高危因素分析

2.2.1 aGVHD發(fā)生與未發(fā)生組MDSCs含量比較 G-CSF動員后發(fā)生aGVHD55例(56.1%)，中位發(fā)生時間為42 d(7～88 d)。根據(jù)aGVHD的發(fā)生情況將患者分為aGVHD發(fā)生組(n=55)與aGVHD未發(fā)生組(n=43)。移植后30、60、90 d，aGVHD發(fā)生組MDSCs含量均低于aGVHD未發(fā)生組，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖1 MDSCs表達(dá)的流式圖

表1 aGVHD發(fā)生與未發(fā)生組MDSCs含量比較

2.2.2 aGVHD發(fā)生組病情控制前后MDSCs含量比較 移植后30、60、90 d，aGVHD發(fā)生組病情控制后的MDSCs含量均高于控制前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2.3 aGVHD發(fā)生與未發(fā)生組Th1及Th2型細(xì)胞因子、CD4+CD25+Treg細(xì)胞含量比較 移植后30、60、90 d，aGVHD發(fā)生組IL-10及CD4+CD25+Treg細(xì)胞含量均低于aGVHD未發(fā)生組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組TGF-β、TNF-α、IL-6比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 aGVHD發(fā)生組病情控制前后MDSCs含量比較

2.2.4 aGVHD發(fā)生的多因素Logistic回歸分析 Logistic回歸分析結(jié)果顯示，MDSCs、IL-10、CD4+CD25+Treg細(xì)胞含量均為aGVHD發(fā)生的獨立影響因素(P<0.05)。見表4。

3 討論

既往有研究報道，MDSCs表達(dá)與B細(xì)胞淋巴瘤[5]和血液病患者[6]的不良預(yù)后相關(guān)；但也有研究報道，MDSCs在感染性疾病[7]、自身免疫性疾病[8]中具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。上述研究均表明，MDSCs可顯著抑制T細(xì)胞增殖。近年來，MDSCs誘導(dǎo)免疫耐受的機制在異基因移植中誘導(dǎo)移植免疫耐受、提高臨床治療效果方面提供了新思路。

本研究中，30例健康供者G-CSF動員后第5天外周血及外周血干細(xì)胞采集物中MDSCs含量高于動員前；同時，MDSCs含量在aGVHD患者中呈低表達(dá)，提示MDSCs的表達(dá)在aGVHD發(fā)生中具有重要價值；而G-CSF的刺激可提高MDSCs表達(dá)，可能對疾病的防治有一定價值。MDSCs降低aGVHD發(fā)生率的機制與抑制T細(xì)胞免疫功能有關(guān)，而該通路可通過多個途徑實現(xiàn)[9]。T前體細(xì)胞在抗原的刺激下，可選擇性分化為Th1、Th2、Th17等細(xì)胞，早期研究證實了Th1類細(xì)胞因子γ干擾素、TNF-α等促進aGVHD的發(fā)生，而Th2類細(xì)胞因子能抑制γ干擾素的分泌而減輕aGVHD[10]。Thl/Th2細(xì)胞比例與單倍體組高aGVHD發(fā)病有關(guān)，可抑制免疫反應(yīng)，其主要通過分泌IL-10和TGF-β來實現(xiàn)，IL-10能夠下調(diào)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，是對aGVHD的負(fù)性調(diào)節(jié)[11]。若對宿主組織器官予以保護，可減輕宿主組織器官炎性細(xì)胞因子的過度分泌，使移植后細(xì)胞免疫類細(xì)胞因子的產(chǎn)生趨于平衡，從而改善aGVHD。本研究結(jié)果還顯示，移植后MDSCs含量變化與aGVHD的發(fā)生與緩解同步發(fā)生，進一步證實MDSCs直接參與了aGVHD的發(fā)生發(fā)展。

Luo等[12]采用骨髓和/或外周血移植，aGVHD累積發(fā)生率為57.4%。本研究采用RH-PBSCT模式，輸注經(jīng)G-CSF動員高劑量的非體外去T細(xì)胞外周血單個核細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，aGVHD累積發(fā)生率為56.1%，低于Luo等[12]報道結(jié)果，提示單倍體組預(yù)處理方案中加用ATG，具有較持久的T細(xì)胞清除和加快移植物的嵌合作用。本研究移植模式主要分為4個方面：一是G-CSF動員供者非體外去T細(xì)胞高劑量單個核細(xì)胞回輸；二是清髓性預(yù)處理方案，2～3個位點不合者采用TBI/CY或ABU/CY+ATG，1個位點不合者不加ATG；三是aGVHD預(yù)防方案，2～3個位點不合者采用CsA/Tac+短程MTX+MMF+抗CD25單克隆抗體+GLU，1個位點不合者則不加抗CD25單克隆抗體；四是預(yù)防感染措施加強，包括細(xì)菌、真菌和病毒等感染防控力度均加強。G-CSF可通過下調(diào)CD28/B7分子表達(dá)和增加DC2 APC表達(dá)，阻斷正性共刺激分子后，促進Th1細(xì)胞能更多地分化為Th2，增加的Th2細(xì)胞及其分泌的因子與誘導(dǎo)免疫耐受和G-CSF動員出較多的MDSCs有關(guān)。本研究結(jié)果表明，MDSCs、IL-10、CD4+CD25+Treg細(xì)胞含量為aGVHD發(fā)生的獨立影響因素(P<0.05)。G-CSF動員干細(xì)胞可促使Th1向Th2轉(zhuǎn)化，從而減少aGVHD的發(fā)生，并使相關(guān)免疫細(xì)胞因子呈低反應(yīng)性。有研究報道，單倍體組部分患者輸注了高劑量CD34+細(xì)胞，其中部分細(xì)胞能特異地殺滅識別其表面抗原的受體前體細(xì)胞毒T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)免疫耐受，促進植入，減少aGVHD的發(fā)生[13]。

表3 aGVHD發(fā)生與未發(fā)生組Th1及Th2型細(xì)胞因子、CD4+CD25+Treg細(xì)胞含量比較濃度/pg·ml-1)

表4 aGVHD發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

綜上所述，RH-PBSCT后血清免疫指標(biāo)MDSCs IL-10、CD4+CD25+Treg細(xì)胞含量的降低對早期診斷aGVHD有一定的輔助價值。