殼寡糖調節腸道菌群對大鼠急性胰腺炎治療效果研究

劉 旭， 趙 巖， 韓 浩， 羅婭媛， 白燕鷗

1.北部戰區總醫院 消化內科，遼寧 沈陽 110016；2.中國科學院金屬研究所沈陽材料科學國家研究中心，遼寧 沈陽 110016

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見的急腹癥，近年來發病率呈上升趨勢[1]。有研究表明，AP病程中腸道微生態受到炎癥應激的干擾，損傷腸屏障功能，導致腸黏膜通透性增加、細菌移位及內毒素血癥，誘發機體二次感染，造成全身炎癥反應綜合征加重，多器官功能障礙，當AP發展為重癥AP時甚至可導致患者死亡[2]。因此，針對AP患者腸道微生態的研究越來越受到關注。殼寡糖(chitooligosaccharide，COS)是殼聚糖或甲殼素通過化學或酶水解從蝦和蟹殼等天然物種中提取而成[3]，具有抗氧化、抗炎、抗菌和免疫調節特性[4]。多項研究表明，COS對腸道微生態紊亂有一定的治療作用[5-9]。本研究構建AP大鼠模型并應用COS進行治療，旨在探討COS調節腸道菌群治療大鼠AP的療效。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取20只SPF級健康雄性6～8周SD大鼠為研究對象。大鼠體質量(300±10)g，購自浙江省醫院動物實驗中心。將大鼠常規喂食1周后，按照隨機數字表法將其分為對照組與治療組，每組各10只。

1.2 AP動物模型制備 大鼠于術前12 h禁食，自由飲水。腹腔注射戊巴比妥溶液(2 mg/100 g)麻醉。開腹后用3.5%牛黃膽酸鈉(1 ml/1 000 g)，以0.2 ml/min的速度沿胰膽管逆行注射，觀察5～10 min后關腹。注射24 h內，觀察大鼠焦慮、煩躁等表現，詳細記錄。造模成功后，治療組給予10% COS灌胃，每8 h灌胃1次，每次5 ml，共進行24 h。對照組給予等劑量生理鹽水灌胃。

1.3 樣本采集 血清采集：單手固定大鼠，大鼠眼眶靜脈采集血液，靜置30 min后放入離心機，3 000 r/min離心10 min，取上清液。糞便采集步驟：固定大鼠，將大鼠直立，擠壓大鼠腸道，促進排便，用ep管收集糞便。研究結束后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，收集各組樣本的胰腺、腸組織，將組織放入10%福爾馬林溶液中固定，糞便置于凍存管后，立即放入-80℃保存，待進一步檢測。

1.4 HE染色 兩組胰腺、腸組織固定24 h后，按常規方法進行脫蠟、水合，將切片用二甲苯浸泡5 min，更換二甲苯后再浸泡5 min；無水乙醇中浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；85%乙醇中浸泡5 min；70%乙醇中浸泡5 min，磷酸鹽緩沖液浸洗3次，每次3 min。浸入試劑盒染色。兩組組織在生物倒置顯微鏡下觀察。腸道組織病理評分以Chiu′s 腸組織損傷評分標準[10]為參考，胰腺組織病理評分以Schmidtt胰腺組織評分標準[11]為參考。

1.5 16S rDNA基因組的測序 參照糞便基因DNA提取試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)說明書抽提糞便菌群DNA，抽提所得DNA采用NanoDrop微量分光光度計檢測和瓊脂糖凝膠電泳進行質檢。將質檢合格的基因組DNA純化后進行兩輪聚合酶鏈式反應擴增。使用AMPure XP Beads 對第二輪擴增產物進行純化，使用ABI StepOnePlus實時熒光定量聚合酶鏈式反應系統(Life Technologies，美國)進行定量，根據Novaseq 6000 的PE250 模式pooling 上機測序。

2 結果

2.1 兩組大鼠血液檢查結果比較 治療組血清淀粉酶下降幅度與血清脂肪酶下降幅度大于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠血液檢查結果比較

2.2 兩組大鼠胰腺組織HE染色結果 HE染色結果顯示，對照組大鼠胰腺組織結構紊亂，間質彌漫性水腫，胰腺腺泡未見大量壞死細胞，有少量出血灶，有少量炎癥細胞浸潤。治療組大鼠胰腺組織結構比較清晰，見區域性水腫，無出血灶和壞死細胞，少量炎癥細胞浸潤。見圖1。

2.3 兩組大鼠腸道組織HE染色結果 對照組大鼠腸黏膜固有層嚴重水腫，絨毛頂端脫落，形態不規則，腸黏膜上皮細胞大量壞死，可見固有層裸露和絨毛脫落。治療組大鼠腸黏膜固有層水腫較對照組輕，絨毛形態不規則及上皮細胞壞死較對照組減輕。見圖2。

2.4 兩組大鼠糞便中腸道菌群比較 治療組veillonella菌屬、Ruminiclostridium菌屬、Prevotellaceae_UCG_001菌屬、Parabacteroides菌屬、Odoribacter菌屬、Muribaculum菌屬、Lachnospiraceae_UCG-006菌屬、Helicobacter菌屬顯著多于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

AP病程中常因腸道供血減少等因素導致腸道微循環障礙[12]，損傷腸道黏膜屏障功能。AP還常伴有腸道蠕動減少甚至消失，腸道正常的清道夫功能減弱，致病菌數量增加，誘發腸道菌群失調[13]。腸道黏膜屏障受損、腸道動力減退、腸內菌群失調及宿主免疫功能受損等可導致細菌移位的發生[14]，進而引起胰腺或胰周組織壞死感染，加重病情，甚至危及生命。因此，針對AP腸道微生態的治療越來越受到臨床關注。

圖1 兩組大鼠胰腺組織HE染色結果(a.對照組；b.治療組；HE×400)

圖2 兩組大鼠腸道組織HE染色結果(a.對照組；b.治療組；HE×400)

圖3 兩組大鼠造模24 h后腸道菌群比較

國際醫學營養食品學會將COS稱為除糖、蛋白質、脂、維生素和無機鹽之后的“第六大生命要素”[15]。針對此類要素對腸道微生態的研究已逐漸開展[6-9]。本研究結果顯示，經過灌胃法給予COS后，構建的大鼠AP動物模型血清淀粉酶、脂肪酶恢復更快，胰腺組織的炎癥表現更輕，證明了其對AP的治療作用；進一步針對大鼠腸道的檢查發現，COS治療組大鼠的腸道黏膜的炎癥表現優于對照組；糞便菌群研究顯示，COS治療24 h后大鼠糞便中的多個菌屬數量均明顯多于對照組。因此，筆者分析COS治療大鼠AP的機制可能是應用COS增加了AP大鼠腸道菌群的多樣性和豐富性，更好地調控了腸道菌群的平衡，進而降低了有害菌的數量，保護了腸道黏膜屏障。

綜上所述，COS灌胃對大鼠AP有一定的治療作用，且可能與其通過調節腸道菌群、保護腸黏膜屏障作用有關。但由于腸道菌群的綱、門、科、屬、種分類繁多，本研究僅從菌屬層面探討了兩組AP大鼠的腸道微生態變化。因此，仍需要通過進一步更全面、深入的研究予以證實。