應激因素對大鼠腸道菌群影響及機制研究

賀 星， 劉 衛， 朱 斌， 嚴和中， 唐 郡

解放軍聯勤保障部隊第九〇一醫院 消化內科，安徽 合肥 230031

應激是指機體穩定的內環境受到外來非特異性的刺激而出現的一種不協調狀態[1]，可影響下丘腦-垂體-腎上腺軸和自主神經系統，導致皮質醇水平釋放增加[2-3]。應激與腸道疾病，如炎癥性腸病、腸易激綜合征及其他功能性胃腸疾病密切相關[4-5]。而腸道微生物-腦-腸軸障礙可能是應激導致腸道疾病的重要病理基礎[6]，提示應激可通過影響腸道微生態引起腸道癥狀。但應激如何作用于腸道菌群及其機制研究報道少見。本研究旨在探討應激對大鼠腸道菌群變化的影響及可能機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取20只雌性SPF級Wistar大鼠為研究對象[7-8]，體質量(160±10)g，購于北京科宇動物養殖中心。大鼠均被安置于獨立代謝籠內，平衡飼養3 d。將大鼠隨機分為A組與B組，每組各10只。B組大鼠接受急-慢結合應激刺激(7種慢性應激，1種急性應激)，A組大鼠不給予特殊干預。

1.2 實驗儀器與設備 光源實時控制儀(樂清彼華電器，型號CHNT)，電熱恒溫培養箱(天津市泰斯特儀器有限公司，型號DH5000)，動脈夾(北京合理科創，型號DMJ-1.6)，水平振蕩器(金壇市城西崢嶸實驗儀器廠，型號SHZ-82)，大鼠固定器(北京搏貝科技有限公司，型號BB-500GB)。

1.3 研究方法

1.3.1 應激方法 采用急-慢應激法[9]刺激大鼠，具體包括：夜間連續照明12 h，禁水24 h，45℃悶熱的環境中5 min，夾尾1 min，4℃寒冷的環境中3 min，食物剝奪24 h，水平振動(120次/min)40 min。每7 d隨機順序給予一次上述刺激，每連續2 d給予的刺激順序不能相同，使大鼠無法預知刺激的發生，連續刺激3周，然后休息1周。再給予1 h紙帶束縛前肩、前上肢、胸部，限制前上肢搔抓頭面部，但不限制其活動。

1.3.2 大鼠腸道癥狀檢測 采用避水應激法[10]測量大鼠排便量。觀察記錄1 h排便粒數(干便)或者次數(濕便)。于試驗28～31 d連續記錄5次數值，取平均值。通過濾紙印記判斷濕便次數，記錄24 h內大便總次數、濕便次數。于造模30 d記錄兩組大鼠濕便率。

濕便率=濕便數/總便數×100%

1.3.3 HE染色 取大鼠遠端結腸組織，按照固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、鋪片與撈片、烤片順序制備石蠟切片[11]。然后使用Olympus光學顯微鏡放大200倍觀察大鼠乙狀結腸黏膜上皮結構是否完整，腺體及隱窩結構是否缺失。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測大鼠糞便菌群。大腸桿菌、雙歧桿菌及乳酸桿菌目的基因引物如下(5′to 3′)：大腸桿菌上游引物CGGCAACGAGCGCAACCC，下游引物CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC；雙歧桿菌上游引物GATTCTGGCTCAGGATGAACGC，下游引物CTGATAGGACGCGACCCCAT；乳酸桿菌上游引物AGCAGTAGGGAATCTTCCA，下游引物CACCGCTACACATGGAG。

1.3.5 蛋白免疫印跡法法檢測腸道組織中 claudin-1 按照總蛋白質提取、蛋白濃度測定、配置十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠、上樣、電泳、轉膜、免疫反應、化學發光、檢測的順序進行[12]。claudin-1所需抗體(生產廠家為abcam；規格ab15098)；內參β-actin抗體(生產廠家為abcam；規格ab8227)。

1.3.6 酶聯免疫吸附法 離心靜脈血及糞便標本，收集后置于-70℃低溫冰箱保存。采用酶聯免疫吸附法檢測試劑盒(Boster，武漢博士德)檢測血清白細胞介素(interleukin，IL)-10、IL-8及腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor α，TNF-α)的水平。操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 兩組大鼠腸道癥狀比較 B組大鼠1 h排便量為(7.14±0.84)次，明顯高于A組的(0.82±0.42)次，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。B組大鼠濕便率為(12.15%±0.85%)，明顯高于A組的0，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 兩組大鼠腸道主要菌群計數比較 B組大鼠雙歧桿菌、乳酸桿菌計數低于A組，大腸桿菌計數高于A組，兩組比較，差異有統計學意(P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠腸道主要菌群計數比較

2.3 兩組大鼠血清炎癥因子水平比較 B組IL-8、TNF-α高于A組， IL-10低于A組，兩組比較，差異有統計學意(P<0.05)。見表2。

2.4 兩組大鼠腸道組織claudin-1蛋白表達比較 B組claudin-1蛋白表達低于A組，兩組比較，差異有統計學意(P<0.05)。見圖1。

2.5 兩組大鼠結腸黏膜結構比較 A組大鼠腸上皮完整，腺體正常，排列整齊，隱窩結構存在。部分B組大鼠出現上皮變性、壞死，隱窩結構消失，但是病變相對局限。見圖2。

3 討論

臨床中，壓力事件可引起或加重腹痛等消化道癥狀，急性壓力可導致內臟感覺閾值降低[13]。結合目前腸道微生態與腸道疾病發病的相關研究，考慮應激可能通過腦-腸-微生態軸導致消化道癥狀的發生[14]，但其具體機制仍未完全確定。本研究采用的應激方法針對大鼠的睡眠、運動、飲食、情緒及感知，并且反復隨機刺激，旨在使大鼠產生一種應激與適應的相對平衡狀態。通過29 d的作用，大鼠出現了明顯的消化道癥狀，排便次數和濕便比例明顯升高，證明了應激刺激在消化道疾病中的作用，與相關研究[15-16]結果一致。為了進一步明確應激對大鼠腸道菌群的影響，本研究分析比較了兩組大鼠腸道主要菌群的差異，B組腸道有益菌雙歧桿菌及乳酸桿菌低于A組，而大腸桿菌高于A組，提示應激可以改變大鼠腸道菌群的構成和比例。近年來，腸道菌群在腸道疾病發病機理中的作用備受關注[17]。有研究發現，慢性壓力可以通過神經內分泌系統導致腸道菌群失調[18-19]，與本研究結果一致，但是具體機制相關研究較少[20]。

表2 兩組大鼠血清炎癥因子水平比較

圖1 免疫印跡法檢測大鼠claudin-1蛋白表達

圖2 兩組大鼠結腸黏膜顯微結構(a.B組大鼠結腸黏膜結構；b.A組大鼠結腸黏膜結構；HE×200)

本研究發現，應激刺激后的大鼠促炎因子IL-8、TNF-α明顯高于A組，抑炎因子IL-10低于A組，提示應激可以導致大鼠出現炎性反應，其原因可能是應激因素通過激活促腎上腺皮質激素釋放因子系統，作用于肥大細胞，產生促炎因子，導致腸道局部炎性反應[21]。本研究對大鼠腸道黏膜微觀結構進行觀察發現，B組大鼠部分腸道黏膜出現上皮變性、壞死，部分結構消失，在大鼠腸道黏膜沒有接受直接理化刺激的前提下，考慮該變化為炎性反應造成。為了明確局部炎性反應對大鼠腸黏膜屏障的影響，本研究分析了腸道組織緊密連接蛋白claudin-1[22]，claudin-1可反映腸黏膜的完整性[23]，結果發現，B組大鼠claudin-1染色明顯淺于A組大鼠，提示B組大鼠腸道完整性受到破壞，腸黏膜屏障及腸黏膜完整性破壞，影響腸道菌群的定植環境，從而導致菌群失調。

綜上所述，應激因素可以通過影響腸道菌群的種類和比例從而產生消化道癥狀，其機制可能與應激導致的炎性反應破壞腸黏膜屏障及腸黏膜完整性相關。