粒細(xì)胞集落刺激因子治療脊髓損傷的作用機(jī)制及臨床研究進(jìn)展▲

唐 云 許建文

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧市 530001，電子郵箱：392052833@qq.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，南寧市 530021)

【提要】 脊髓損傷具有很高的發(fā)病率和致殘率，可引起嚴(yán)重的神經(jīng)損傷，目前尚無(wú)有效的方法使其功能完全恢復(fù)。在動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中，已經(jīng)觀察到粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)脊髓損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。本文針對(duì)粒細(xì)胞集落刺激因子治療脊髓損傷的作用機(jī)制研究及臨床應(yīng)用研究進(jìn)行綜述，以期為脊髓損傷的治療提供新的思路，從而更好地改善脊髓損傷患者的預(yù)后。

脊髓損傷是由外力直接或間接作用于脊髓而導(dǎo)致的損傷，是一種常見的可導(dǎo)致永久性殘疾的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，伴有感覺和運(yùn)動(dòng)功能喪失、自主神經(jīng)功能紊亂[1-2]。脊髓損傷分為原發(fā)性和繼發(fā)性損傷兩個(gè)階段，其中原發(fā)性脊髓損傷是由機(jī)械創(chuàng)傷引起的，病理生理學(xué)變化包括軸突、血管和細(xì)胞膜的破壞等。繼發(fā)性損傷是原發(fā)性機(jī)械損傷之后的階段，是一種細(xì)胞和分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可引起水腫、缺血、興奮性毒性、自由基產(chǎn)生、炎癥和凋亡等[3-4]。研究表明，脊髓修復(fù)過程中所面臨的主要障礙是繼發(fā)性損傷，通過適當(dāng)?shù)耐庠葱愿深A(yù)可以減少繼發(fā)性損傷，改善神經(jīng)功能，促進(jìn)脊髓損傷患者的恢復(fù)[5]。由于對(duì)神經(jīng)功能障礙疾病治療及康復(fù)需求的日益增加，臨床上需要更為有效的脊髓修復(fù)和再生療法，以提高患者的生活質(zhì)量。

研究表明，造血生長(zhǎng)因子如促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、各種集落刺激因子等在血液祖細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、分化中發(fā)揮重要作用，部分細(xì)胞因子已被證實(shí)能夠影響神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的增殖，且大多數(shù)在大腦中有特定的受體[6]。粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)是一種低分子糖蛋白，主要由內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓基質(zhì)成纖維細(xì)胞以及免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生[7]。G-CSF受體屬于Ⅰ型細(xì)胞因子受體超家族，在許多腦區(qū)廣泛表達(dá)，如海馬、腦室下區(qū)、小腦等。G-CSF可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)源性配體，與G-CSF受體結(jié)合后被激活，從而發(fā)揮多種生物學(xué)作用[8-9]。G-CSF在臨床上被廣泛用于治療中性粒細(xì)胞減少癥，以及動(dòng)員外周血來源的造血干細(xì)胞以用于移植，隨著對(duì)G-CSF作用機(jī)制研究的不斷深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)G-CSF除了造血功能以外，還具有神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生功能，是重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。例如，G-CSF在腦卒中、肌萎縮性側(cè)索硬化、阿爾茲海默病、創(chuàng)傷性腦損傷等神經(jīng)損傷性疾病中發(fā)揮重要作用[10-13]。也有越來越多的學(xué)者研究G-CSF對(duì)脊髓損傷的影響，故本文就G-CSF在脊髓損傷中的作用機(jī)制及臨床研究做一綜述。

1 G-CSF治療脊髓損傷的作用機(jī)制

1.1 抗凋亡作用及促進(jìn)自噬 G-CSF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有雙重活性，不僅能增加腦缺血后的長(zhǎng)期可塑性，有利于減輕急性神經(jīng)元變性，還可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體應(yīng)激從而對(duì)受損神經(jīng)元起到保護(hù)作用，并通過減少促凋亡蛋白和增加抗凋亡蛋白來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[14]。研究表明，給予G-CSF治療慢性脊髓壓迫大鼠8周后能顯著減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量，保護(hù)前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元[15]；小鼠脊髓橫斷損傷后，給予G-CSF治療可以上調(diào)抗凋亡G-CSF靶基因B細(xì)胞淋巴瘤-XL(B-cell lymphoma-extra large,Bcl-XL)的表達(dá)，此外，G-CSF在大鼠分離的海馬神經(jīng)元中具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)特性，可以增強(qiáng)海馬神經(jīng)元的神經(jīng)突生長(zhǎng)能力[16]。這提示G-CSF作為神經(jīng)生長(zhǎng)因子，通過抗細(xì)胞凋亡而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用。還有學(xué)者在小鼠脊髓半切損傷模型中發(fā)現(xiàn)，G-CSF受體和抗凋亡蛋白核仁磷酸蛋白1在脊髓神經(jīng)元上均有表達(dá)，G-CSF的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能與核仁磷酸蛋白1抑制神經(jīng)元凋亡有關(guān)[17]。G-CSF受體在少突膠質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)，Kadota等[18]研究G-CSF對(duì)脊髓損傷后大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)G-CSF上調(diào)能促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達(dá)，減少少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，且促進(jìn)大鼠后肢功能的恢復(fù)。 此外，細(xì)胞自噬是機(jī)體重要的防御和保護(hù)機(jī)制，在脊髓損傷后的細(xì)胞修復(fù)中發(fā)揮重要作用，脊髓損傷后細(xì)胞自噬水平的升高可減輕神經(jīng)元損傷[19]。研究顯示，G-CSF可以誘導(dǎo)損傷脊髓中自噬的激活，通過抑制核因子κB信號(hào)通路和保護(hù)脊髓損傷后神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，促進(jìn)自噬并減少神經(jīng)元凋亡[20]。

1.2 抑制炎癥反應(yīng) 炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性脊髓損傷的主要機(jī)制之一，脊髓損傷后炎癥相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷，因此有效控制損傷后的過度炎癥反應(yīng)，可以減少脊髓損傷后的繼發(fā)性病變。研究表明，G-CSF可以減輕大鼠缺氧缺血后神經(jīng)炎癥反應(yīng)并穩(wěn)定血腦屏障[21]。有學(xué)者建立了小鼠脊髓半切模型，發(fā)現(xiàn)G-CSF能在脊髓損傷后72 h內(nèi)將小膠質(zhì)細(xì)胞招募到損傷部位；此外，G-CSF在BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中能夠抑制炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)的表達(dá)，增加M2巨噬細(xì)胞表型標(biāo)記物并降低M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，有利于小膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓半切微環(huán)境下的M2極化；G-CSF還可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的選擇性激活，并通過阻斷核因子κB信號(hào)通路，減少早期炎癥所致的有害影響，促進(jìn)有利于修復(fù)的抗炎反應(yīng)[22]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)50 μg的G-CSF可以降低脊髓挫傷大鼠中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛濃度和髓過氧化物酶活性，保護(hù)脊髓免受損傷后中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)[23]。

1.3 促進(jìn)干細(xì)胞動(dòng)員 G-CSF是一種常用的干細(xì)胞動(dòng)員劑，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)員造血干細(xì)胞從骨髓釋放到外周血中。在穩(wěn)態(tài)條件下，造血干細(xì)胞通過趨化因子CXCL12/基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1和趨化因子受體CXCR4的相互作用保留在骨髓中；G-CSF可以激活骨髓中的中性粒細(xì)胞，釋放組織蛋白酶G、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶9等蛋白水解酶，來破壞CXCL12和CXCR4之間的相互作用，使得造血干細(xì)胞從骨髓釋放到外周血[24]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，G-CSF動(dòng)員是一種成功富集大鼠外周血間充質(zhì)干細(xì)胞(peripheral blood-derived mesenchymal stem cell，PBMSC)的方法，同時(shí)可用于維持細(xì)胞移植的MSC表型；而將經(jīng)G-CSF動(dòng)員獲得的PBMSC植入脊髓損傷大鼠體內(nèi)后，大鼠的運(yùn)動(dòng)功能得到改善[25]。Takahashi等[26]的研究表明，脊髓內(nèi)移植G-CSF動(dòng)員的CD34+細(xì)胞或單個(gè)核細(xì)胞可促進(jìn)血管生成、抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和脫髓鞘。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，G-CSF與造血細(xì)胞因子FMS樣酪氨酸激酶3配體協(xié)同作用，動(dòng)員造血祖細(xì)胞進(jìn)入外周血，可增加血液中可用骨髓干細(xì)胞的數(shù)量，這兩種因子的結(jié)合可進(jìn)一步延長(zhǎng)骨髓細(xì)胞的動(dòng)員作用[27]。

1.4 促進(jìn)血管生成 局部血管和血腦屏障受損會(huì)導(dǎo)致炎癥和缺血，從而造成脊髓神經(jīng)組織的整體損傷，受損神經(jīng)組織的自我修復(fù)能力有限，因此，減少血管損失和恢復(fù)血管功能，以及促進(jìn)新血管的形成，有助于脊髓損傷后的功能恢復(fù)[28]。有研究顯示，大鼠實(shí)驗(yàn)性脊髓壓迫損傷后，給予G-CSF和平板運(yùn)動(dòng)等治療可以增加損傷脊髓血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)，促進(jìn)血管生成[29]。在大鼠脊髓缺血模型中，G-CSF也可上調(diào)損傷后VEGF-A的表達(dá)[30]。有學(xué)者使用G-CSF治療脊髓挫傷后的大鼠，發(fā)現(xiàn)直徑大于20 mm的血管總數(shù)增多，VEGF、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2表達(dá)水平增高，提示脊髓損傷后G-CSF通過促進(jìn)血管生成發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，即血管生成有助于神經(jīng)組織的再生反應(yīng)[31]。

1.5 促進(jìn)神經(jīng)修復(fù) 已有研究表明，給予G-CSF治療坐骨神經(jīng)橫斷小鼠，可以提高神經(jīng)修復(fù)潛力，改善神經(jīng)再生[32]。Pang等[33]發(fā)現(xiàn)，G-CSF可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的牙源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及其腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)生長(zhǎng)因子的分泌，利用G-CSF和牙源性神經(jīng)干細(xì)胞移植聯(lián)合治療脊髓挫傷大鼠，大鼠的行為障礙有所改善。軸突的生長(zhǎng)被認(rèn)為是神經(jīng)再生和修復(fù)的一個(gè)關(guān)鍵過程，而G-CSF有利于受損軸突的修復(fù)。例如，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在大鼠脊髓挫傷后給予G-CSF治療，可以下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的表達(dá)，降低Ras同源基因(Ras homolog gene,Rho)/Rho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶的活性，從而形成有利于軸突生長(zhǎng)的環(huán)境[34]；早期給予脊髓損傷大鼠G-CSF治療可抑制硫酸軟骨素蛋白多糖的表達(dá)，保護(hù)軸突纖維免受破壞性損傷，對(duì)軸突再生和功能恢復(fù)具有有益作用[35]；Lee 等[36]的研究也顯示，給予G-CSF治療脊髓損傷大鼠，可以明顯減少軸突的斷裂、脫髓鞘，且促進(jìn)軸突發(fā)芽和再生。

1.6 抗興奮性毒性 興奮性氨基酸(excitatory amino acid,EAA)的釋放也是脊髓損傷后重要的繼發(fā)性損傷因素，EAA過度激活谷氨酸受體可導(dǎo)致自由基產(chǎn)生、繼發(fā)性興奮毒性、線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)激活等不良后果[37]。已有研究表明，G-CSF干預(yù)可以抑制缺血性腦卒中后的興奮性毒性[38]。Chen等[39]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)脊髓缺血大鼠予注射G-CSF，可抑制EAA的釋放，并調(diào)節(jié)脊髓內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，發(fā)揮抗興奮性毒性作用。

1.7 鎮(zhèn)痛 研究表明，在慢性壓迫性損傷大鼠模型中，給予G-CSF干預(yù)可緩解神經(jīng)性疼痛的機(jī)制與激活白細(xì)胞源性內(nèi)源性阿片類物質(zhì)分泌、下調(diào)IL-6和TNF-α的表達(dá)有關(guān)[40]。Kato等[41]發(fā)現(xiàn)在大鼠脊髓挫傷3周后給予連續(xù)5 d腹腔注射重組人G-CSF，可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低p38絲裂原活化蛋白激酶和IL-1β的表達(dá)，從而減輕挫傷所致機(jī)械性痛覺超敏。也有研究表明，G-CSF可減輕大鼠脊髓損傷后的熱痛覺過敏和冷觸誘發(fā)痛[42]。以上研究結(jié)果提示，G-CSF可治療脊髓損傷引起的神經(jīng)性疼痛，從而有助于脊髓損傷患者的病情恢復(fù)。

2 G-CSF治療脊髓損傷的臨床研究

目前，有關(guān)G-CSF的應(yīng)用，已在眾多領(lǐng)域中開展了一系列相關(guān)的臨床試驗(yàn)，大部分研究結(jié)果顯示G-CSF的療效肯定且并發(fā)癥少。近年來，許多學(xué)者也將其應(yīng)用于脊髓損傷的治療中，探討其安全與有效性。

2.1 脊髓損傷急性期 Derakhshanrad等[43]報(bào)告了1例應(yīng)用G-CSF和MSCs聯(lián)合治療急性脊髓損傷的病例，患者治療后神經(jīng)功能得到改善，因此認(rèn)為該方案可作為常規(guī)康復(fù)方案的輔助治療。Takahashi等[44]進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ/Ⅱa臨床試驗(yàn)，納入16例發(fā)病48 h以內(nèi)的脊髓損傷患者，其中5例患者給予連續(xù)5 d靜脈注射[5 μg/(kg·d)]G-CSF，另外11例患者給予10 μg/(kg·d)G-CSF；結(jié)果顯示，10 μg組的美國(guó)脊髓損傷協(xié)會(huì)(American Spinal Injury Association,ASIA)運(yùn)動(dòng)和感覺評(píng)分顯著提高，其中2例患者出現(xiàn)尿路感染，經(jīng)抗生素治療后痊愈，1例患者出現(xiàn)輕度肝功能障礙，可自行緩解，未發(fā)生其他嚴(yán)重不良事件。隨后進(jìn)行的多中心、前瞻性、非隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)5 d靜脈注射10 μg/(kg·d) G-CSF治療的患者治療后1周及1年的ASIA運(yùn)動(dòng)評(píng)分均優(yōu)于未使用G-CSF治療的患者，進(jìn)一步證實(shí)G-CSF對(duì)急性脊髓損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用[45]。此外，Kamiya等[46]比較接受G-CSF與接受甲潑尼龍琥珀酸鈉治療的急性脊髓損傷患者的臨床效果和藥物相關(guān)不良事件，發(fā)現(xiàn)后者的肺炎發(fā)病率(44.1%)明顯高于前者(3.6%)，而前者在促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)方面具有更好的效果。綜上所述， G-CSF治療急性脊髓損傷具有較好的療效和安全性。

2.2 脊髓損傷慢性期 一項(xiàng)開放性Ⅰ期研究納入19例慢性運(yùn)動(dòng)性脊髓損傷患者，給予皮下注射5 μg G-CSF，治療5 d，并隨訪至少6個(gè)月，結(jié)果表明治療后患者ASIA、國(guó)際神經(jīng)修復(fù)學(xué)會(huì)脊髓損傷功能評(píng)價(jià)量表(International Association of Neurorestoratology Spinal Cord Injury Functional Rating Scale,IANR-SCIFRS)和脊髓獨(dú)立性評(píng)定量表Ⅲ(Spinal Cord Independence Measure Ⅲ,SCIMⅢ)評(píng)分均比治療前提高，在改善膀胱和腸道功能方面也效果顯著[47]。一項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)納入了120例不完全慢性創(chuàng)傷性脊髓損傷患者，其中G-CSF組連續(xù)7 d皮下注射300 μg的G-CSF，而安慰劑組注射生理鹽水，結(jié)果顯示G-CSF組ASIA運(yùn)動(dòng)評(píng)分高于安慰劑組，G-CSF組中僅有少數(shù)患者出現(xiàn)一過性的骨痛、肌肉疼痛、頭痛、惡心、嘔吐等并發(fā)癥[48]。由此可見，對(duì)于慢性脊髓損傷的患者，G-CSF有助于其運(yùn)動(dòng)、感覺功能障礙的恢復(fù)。

2.3 脊髓損傷亞急性期 Derakhshanrad等[49]納入亞急性期不完全創(chuàng)傷性脊髓損傷患者，進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅱ/Ⅲ期前瞻性、安慰劑對(duì)照、雙盲、平行隨機(jī)臨床試驗(yàn)，其中治療組每天皮下注射300 μg G-CSF，連續(xù)7 d，對(duì)照組給予安慰劑；隨訪6個(gè)月后，對(duì)照組的ASIA損傷分級(jí)保持不變，G-CSF組的ASIA損傷分級(jí)有不同程度提高，且G-CSF組脊髓損傷神經(jīng)學(xué)分類國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)動(dòng)評(píng)分、IANR-SCIFRS和SCIMⅢ評(píng)分均優(yōu)于對(duì)照組。這提示，G-CSF可減輕亞急性期不完全創(chuàng)傷性脊髓損傷患者的神經(jīng)損傷，改善其相關(guān)功能。

3 小結(jié)與展望

通過對(duì)不同脊髓損傷模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF可通過抗凋亡、抗炎癥、促進(jìn)干細(xì)胞動(dòng)員、促血管生成、促神經(jīng)發(fā)生、抗興奮性毒性及鎮(zhèn)痛等機(jī)制發(fā)揮治療脊髓損傷的作用，這些基礎(chǔ)研究為G-CSF的應(yīng)用提供了相關(guān)依據(jù)。目前進(jìn)行的臨床試驗(yàn)也表明G-CSF治療脊髓損傷是可行的，G-CSF可促進(jìn)急性、慢性、亞急性期脊髓損傷患者的功能恢復(fù)，為G-CSF臨床應(yīng)用的安全性提供了一定的佐證。但是，目前仍有一些問題需要解決，如損傷后治療的時(shí)機(jī)、G-CSF給藥最佳劑量、用藥途徑、療程等，同時(shí)還應(yīng)結(jié)合患者的年齡、損傷程度、發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)短、藥物耐受等因素制定全面康復(fù)的策略，才能更規(guī)范、安全的運(yùn)用G-CSF。未來也需要開展更多大樣本、多中心的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，進(jìn)一步推進(jìn)G-CSF的臨床運(yùn)用，優(yōu)化脊髓損傷患者的康復(fù)方案。以上基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)研究結(jié)果均表明，G-CSF具有修復(fù)神經(jīng)損傷和神經(jīng)保護(hù)的作用，是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的候選因子，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。