趨化因子受體CXCR4在乳腺癌骨轉移患者乳腺組織中的表達水平及其臨床意義▲

唐超莉 胡洪波 趙苑池 謝一嫏 周 翠 覃文辦 黃 鵬

(廣西崇左市人民醫院腫瘤科，崇左市 530021，電子郵箱:863272700@qq.com)

乳腺癌是女性最常見的上皮性惡性腫瘤，全世界每年約有140萬乳腺癌新發病例和45萬乳腺癌死亡病例[1]。鑒于乳腺癌的惡性生物學行為特征，最終多會出現局部復發與遠處轉移。乳腺癌轉移具有器官選擇性，約75%的乳腺癌轉移患者發生骨轉移[2]。乳腺癌骨轉移常引起頑固性骨痛、高鈣血癥、病理性骨折、肢體功能障礙等一系列骨相關事件，嚴重影響患者生活質量，甚至導致死亡。乳腺癌骨轉移分子機制至今尚未完全明確，目前常用的治療手段主要為姑息性治療，包括局部治療及系統性治療，但均不能延長患者的生存期，而預防性治療乳腺癌骨轉移會引起不必要的副作用，并且成本高。因此，深入研究乳腺癌骨轉移的分子機制，尋找有效的治療靶點顯得尤為重要。趨化因子(C-X-C基序)受體4[chemokine(C-X-C motif) receptor 4，CXCR4]介導的趨化和轉移反應已在各種實體癌癥中得到證實，提示CXCR4是一種趨化因子受體，常在乳腺、結腸和前列腺等器官的實體腫瘤中過度表達[3]。本研究觀察乳腺癌骨轉移患者乳腺組織中CXCR4基因及蛋白的表達水平，為研究乳腺癌骨轉移的早期診斷和靶向治療提供相關理論依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 組織來源 收集2017 年 5月至 2019 年2 月在我院診治的100例乳腺浸潤性導管癌患者(乳腺癌無骨轉移組)與100例乳腺浸潤性導管癌骨轉移患者(乳腺癌骨轉移組)的乳腺組織，均為女性，年齡 21～75(44.65±8.76)歲。患者術前均未接受放化療，其手術切除標本常規石蠟包埋、固定后行蘇木精-伊紅染色，經2位病理醫生按世界衛生組織《乳腺病理組織學分類》(2003 新版)標準[4]讀片，確認其浸潤性導管癌的病理類型，余下組織-80℃保存。收集同期在我院體檢的100健康女性的乳腺組織(正常對照組)，年齡23～74(45.75±8.41)歲。3組研究對象的年齡、絕經情況等一般資料比較，以及乳腺癌無骨轉移組與乳腺癌骨轉移組患者乳腺癌組織學分級的比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經過本院醫學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

表1 3組研究對象一般資料的比較(n)

1.2 免疫組化 對3組研究對象的石蠟包埋塊進行相應處理：(1)選好各組研究對象組織切片，60℃恒溫箱過夜。(2)脫蠟脫水：將切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 中各10 min；再依次放入無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、60%乙醇中各5 min。(3)沖洗：自來水沖洗5 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，3 min/次。(4)抗原修復：向壓力鍋中倒入適量pH值=6.0的酸鹽性修復液，修復液必須浸沒整張組織切片，調大火加熱至水沸騰，將已脫蠟水化的切片插入耐高溫的染色架中，放進已煮沸的修復液中，蓋緊鍋蓋，扣好壓力鍋繼續加熱，從噴氣開始計時5 min后，將壓力鍋撤離熱源，放置5 min后，用自來水沖洗使之冷卻。(5)沖洗：取出切片，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3 min；再用配制好的0.9%過氧化氫沖洗15 min；再用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3 min。(6)封閉：每張切片滴加1滴動物血清，37℃溫箱下孵育15 min。(7)加一抗:甩去動物血清，每張切片滴加1滴CXCR4一抗(Abbkine公司，批號：ATSFE2501)， 37℃溫箱下孵育60 min。(8)加二抗：磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3 min。每張切片各滴加1滴二抗(福建邁新公司，批號：1901180014A)，37℃溫箱下孵育30 min。(9)加過氧化物酶：磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3 min。然后每張切片加1滴鏈霉菌抗生物-過氧化物酶溶液，37℃溫箱下孵育15 min。(10)顯色：磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3 min。然后每張切片加二氨基聯苯胺顯色劑，靜置1～3 min。自來水沖洗數分鐘。(11)染色：放入蘇木素中染色3 min后用自來水沖洗數分鐘。再快速過入鹽酸酒精，自來水沖洗數分鐘。(12)晾干切片，滴加樹脂，蓋上載玻片，于顯微鏡下觀察。計數4個不同高倍視野下的200個癌細胞，根據細胞染色情況計算陽性細胞百分數。無陽性細胞數記為陰性(-)，陽性細胞百分數<25%記為弱陽性(+)，陽性細胞百分數25%～49%記為中等陽性(++)，陽性細胞百分數≥50%為強陽性(+++)。由兩名病理學醫師獨立評估，當意見不一致時，由第三位病理學醫師介入，最終的決定是基于三分之二的病理學醫師同意評估。

1.3 PCR方法 采用逆轉錄PCR方法檢測三組患者的CXCR4 mRNA表達情況。 分別取3組研究對象的乳腺組織約100 mg，加入1 mL的TRIzol溶液(Invitrogen公司)進行勻漿，根據RNA說明書提取總RNA。取3 μg總RNA，根據M-MuLV逆轉錄試劑盒(MBI Fermentas公司)說明書逆轉錄為cDNA；在美國MJR公司生產的定量PCR檢測儀上進行實時熒光定量PCR檢測。CXCR4上游引物：5′-ACTACACCGAGGAAATGGGCT-3′,下游引物：5′-CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA -3′，預計產物長度為133 bp;β-肌動蛋白基因上游引物：5′-GGTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3′，下游引物：5′-CCCGGCCAGCCAGGTCCAG-3′， 預計產物長度為388 bp，以上引物均由上海生工生物有限公司設計。反應體系為20 μL:cDNA為1 μL，CXCR4上下游引物各0.5 μL，RealMaster Mix(SYBR Green) (北京天根生物科技有限公司)為9 μL，ddH2O 9 μL。反應條件為：94℃ 5 min，然后94℃ 30 s，62.2℃ 30 s，70℃ 30 s，共40個循環。每份cDNA樣本均在相同反應條件下進行。由定量PCR儀采集熒光信號，電腦自動分析熒光信號并將其轉換為CT值，并根據標準曲線得出拷貝數。通過制作標準曲線對實驗進行質量控制,用內參基因β-肌動蛋白對mRNA含量的變異進行較正。CXCR4精確含量=CXCR4 拷貝數/內參β-肌動蛋白拷貝數。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0進行統計學分析。計量資料采用(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以例數和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組研究對象乳腺組織CXCR4陽性表達情況的比較 3組研究對象乳腺組織CXCR4陽性表達情況的比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，乳腺癌骨轉移患者乳腺組織CXCR4的陽性表達最強，見表2及圖1～4。

2.2 乳腺癌陽性表達情況患者乳腺癌組織CXCR4的陽性表達情況與臨床病理特征的關系 乳腺癌組織CXCR4的陽性表達情況與糖類抗原153(carbohydrate antigen 153，CA153)、雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、人類表皮生長因子2(human epidermal growth factor 2，HER-2)、腫瘤原發灶大小無關(均P>0.05)，而與細胞核增殖相關抗原(Ki-67)、腫瘤分期相關(均P<0.05)，見表3。

表2 3組研究對象乳腺組織CXCR4陽性表達情況的比較[n(%)]

表3 乳腺癌腫瘤組織CXCR4表達情況與患者臨床病理特征的關系(n)

2.3 3組研究對象乳腺組織CXCR4 mRNA相對表達量的比較 正常對照組、乳腺癌無骨轉移組、乳腺癌骨轉移組患者乳腺組織的CXCR4 mRNA相對表達量分別為(0.63±0.21)、(1.15±0.24)、(2.44±0.27)，3組乳腺組織的CXCR4 mRNA相對表達量比較差異有統計學意義(F=1 492.153，P<0.001)，其中乳腺組織的CXCR4 mRNA相對表達量由高到低為乳腺癌骨轉移組>乳腺癌無骨轉移組>正常對照組(均P<0.05)。

3 討 論

乳腺癌是一種異質性疾病，可表現出多種組織病理學和分子特征。CXCR4屬于特異性G蛋白-偶聯受體，是趨化因子基質細胞衍生物-1的特異性受體，與配體具有較高的親和力。趨化因子(C-X-C基序)配體12[chemokine(C-X-C motif)ligand 12，CXCL12]是CXCR4的唯一配體，在多種癌癥中具有自分泌/旁分泌生長因子的作用。與CXCR4結合的CXCL12可啟動各種信號通路，導致基因轉錄、介導細胞趨化、細胞存活和增殖的增加，而且與腫瘤細胞向區域和遠處轉移的能力有關[5]。CXCR4在20多種惡性腫瘤中表達上調，并且與預后不良和侵襲性表型相關。在肝癌中，CXCR4表達與腫瘤大小、遠處播散和患者預后不良有關[6]。在胃癌中，長鏈非編碼RNA HOTAIR表達增加，通過miRNA-126/CXCR4軸和下游信號通路促進胃癌的增殖和轉移[7]。研究表明，CXCR4表達與腎細胞癌患者的腫瘤轉移、腫瘤進展和預后有關,且CXCR4的表達與腎細胞癌患者病理分級、轉移狀態和總生存期顯著相關[8]。CXCR4蛋白在胰腺癌組織中呈高表達，并且與腫瘤的發生發展關系密切[9]。大多數乳腺癌患者CXCR4表達呈陽性,乳腺癌組織CXCR4表達強度與腋窩淋巴結受累呈指數關系，原發腫瘤大小、HER2(+)亞型、淋巴血管浸潤也與CXCR4陽性表達呈指數關系[10-11]。 Yang等[12]的研究表明，CXCR4或CXCR7基因的單次敲除可顯著降低三陰型乳腺癌細胞的增殖、生長、遷移和侵襲，延緩G1/S周期的轉化，而共敲除對這些生物學能力的抑制作用更顯著。Shanmugam等[13]的研究表明，過表達的CXCR4與乳腺癌患者癌細胞增殖、轉移增加有關，也是預后不良的指標之一。Liao等[14]的研究表明，CXCR4可促進破骨細胞形成，在非小細胞癌骨轉移中起關鍵作用。還有研究表明，CXCR4的高表達與乳腺癌骨轉移風險顯著相關，CXCR4陽性患者(13.1%)骨轉移發生率明顯高于CXCR4陰性患者(2.4%)[15-16]。

本研究結果顯示，3組研究對象乳腺組織CXCR4陽性表達情況比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，乳腺癌骨轉移患者乳腺組織CXCR4的陽性表達情況最強，而且乳腺組織的CXCR4 mRNA的相對表達量由高到低為乳腺癌骨轉移組>乳腺癌無骨轉移組>正常對照組(均P<0.05)，與Cabioglu等[15]的研究結果一致，說明CXCR4基因可能成為一個乳腺癌骨轉移的基因治療靶點，其在乳腺癌骨轉移中的作用機制，可能與高表達CXCR4的腫瘤細胞遷移到富含CXCL12的骨髓環境相關。隨著腫瘤轉移的擴散，CXCR4/CXCL12軸影響腫瘤進展的其他方面，包括為骨髓中的腫瘤細胞提供一個保護性的生態位，并通過召集CXCR4陽性的促血管生成細胞支持缺氧驅動的血管生成[17]。本研究結果顯示，乳腺癌組織CXCR4的陽性表達情況與CA153、ER、PR、HER-2、腫瘤原發灶大小無關(均P>0.05)，而與Ki-67、腫瘤分期相關(均P<0.05)，與Pehlivan等[10]的研究結果有所不同，這可能與研究病例數不同有關。Ki-67是細胞增殖活躍的指標，本研究結果顯示Ki-67陽性>14%的乳腺癌細胞中CXCR4表達陽性率更高，而且 CXCR4在惡性程度高、組織學分化差、腫瘤分期晚的乳腺癌組織中表達更高，說明CXR4可能成為評估乳腺癌預后的指標。

綜上所述， CXCR4在乳腺癌組織中的表達升高，且在乳腺癌骨轉移患者乳腺組織中的表達更高，其有可能成為乳腺癌骨轉移治療的新靶點，為乳腺癌骨轉移早期診斷及治療提供新的方向。