猴頭菌分子生物學研究進展*

張亞光，范明松，高 崎**

（1.上海上藥杏靈科技藥業股份有限公司，上海 201703；2.上海雷允上藥業有限公司，上海 200336）

猴頭菌[Hericium erinaceus（Bull.ex Fr.）Pers.]，俗稱猴頭、猴頭菇、陰陽菇、猴菜、刺猬菌等，為擔子菌門 （Basidiomycota） 傘菌綱 （Agariomycetes）紅菇目 （Russulaemetica） 猴頭菌科 （Hericiaceae）的大型食用菌，屬腐木類真菌[1]，廣泛分布于我國河北、內蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、廣西、四川、云南、湖南等地[2]。栽培歷史悠久，種質資源多樣，年產經濟價值達30億元人民幣[3]。猴頭菌食藥兼用，營養價值高；子實體內含抗氧化、免疫調節、抗癌的物質，長期食用可助消化、利脾胃[4]。猴頭菌味甘性平，對各類常見的慢性胃炎、胃潰瘍、胃癌和潰瘍性結腸炎等疾病有一定抑制作用，研究表明發揮該作用的主要活性成分為多糖，可能通過調節SOD酶的變化，降低氧化損傷，發揮抑制胃炎和潰瘍性結腸炎的作用，通過影響胃癌細胞凋亡、遷移和增殖抑制胃癌[5-6]。此外有研究者發現猴頭菌提取物對引起胃病的幽門螺旋桿菌有一定抑制作用[7]。目前國內臨床常用猴頭菌復方制劑或聯合療法，治療慢性胃炎、消化道潰瘍、復發性口瘡等[8-9]。當前以猴頭菌菌絲體為原料，已開發出猴頭菌片、猴頭菇口服液等產品，未來在臨床上應用前景廣闊。

猴頭菌分子生物學研究起步相比我國其他常見大型食用菌較晚。近年來，由于其保健功效和高營養價值，相關研究已經從亞洲局部地區擴展到全世界范圍。研究者通過分子生物學手段全面開展了猴頭菌基因組、轉錄組、次生代謝物等方面研究，其分子生物學研究也取得了較快速進展[4，10]。分子生物學技術全面引入為揭示猴頭菌系統發育進化關系、基源鑒定、種質資源開發、代謝調控機制以及育種和菌種保護等研究提供了分子基礎。現已開展了一定數量的探索不同種類以及不同時期猴頭菌中功能化合物分離鑒定的研究，其中一些功能化合物和相關聯基因深度開發極具前景[11]。作者將從猴頭菌分子標記、種質資源的遺傳多樣性和功能基因等方面研究成果開展綜述，以期為該領域的深入研究提供參考。

1 猴頭菌遺傳物質

1.1 基因組學研究

基因組學技術的進步，為藥用真菌快速鑒定提供了新途徑，其中大多數以DNA同源性為分析基礎。通過將相同表現型的菌株在基因水平上開展鑒定，將猴頭菌的鑒定技術引入分子時代。猴頭菌的全基因組數據量與其他常見的大型食用菌的基因組數據量相比較大[12，14]，檢測工作開展相對困難。通過分析其全基因組數據以及差異，全面呈現出猴頭菌的遺傳多樣性和親緣關系。張琪等[13]優化了猴頭菌原生質體的制備條件，結合熒光染色以及分子鑒定獲得了高純度的單核體，為進一步開展猴頭菌基因組水平的研究提供了材料和基礎。陳娟等[14]首次報道了猴頭菇的基因組序列，通過采用MPS技術獲得了大小為39.35 Mb的基因組序列，編碼蛋白的基因平均序列長度為1 345 bp。龔文斌等[12]完成了猴頭菌單核體更加精確的全長測序和基因組組裝，生成的基因組大小為41.2 Mb，累積編碼了10 620個蛋白編碼基因。這些研究為猴頭菌系統進化分析和基因組水平的重建提供了重要數據。

1.2 轉錄組學研究

近年來，對猴頭菌作為功能食品的需求日益增長引起了研究者的高度關注，針對不同的研究目的，目前已經有一定數量的猴頭菌相關轉錄組學的報道。除了用于分子標記挖掘，該技術還可用于轉錄差異表達、功能基因的克隆和機理研究。陳娟等[14-15]最先研究了猴頭菌單核細胞菌絲、雙核的菌絲體和子實體轉錄組基因表達的差異，并比較了3個時期的高表達的基因，驗證了猴頭菌不同時期下活性化合物的生物合成與基因表達的關聯性。朱伶俐等[16]通過對4個生長發育階段猴頭菌子實體進行轉錄組測序后，分析得出不同時期差異基因。龔文斌等[14]在猴頭菌中發現了多種碳水化合物活性酶，共鑒定出447個轉錄因子共同參與木質纖維素降解的相關過程，與碳代謝過程相關聯。

隨著分子生物學技術的廣泛運用，植物基因克隆、轉錄組測序技術越來越多的應用到真菌的次生代謝物研究中[17]。目前猴頭菌屬真菌活性次級代謝產物的研究已經比較深入，已發現了83種不同類型的活性次級代謝產物，主要包含脂肪酸、生物堿類化合物、萜類化合物、酚類化合物等，這些成分顯示了抗腫瘤、保肝護胃、降血糖、保護神經、抗癌、抗衰老、抗氧化等多種生物學功能[18]。張靜等[19-20]詳細介紹了猴頭菇活性成分及其功能性的研究進展，但就目前而言，有關猴頭菌轉錄組學研究方面內容缺乏，且不夠系統。劉高強等[21]通過14C標記示蹤技術，分析測定了葡萄糖的代謝流動，已經構建出靈芝內多糖的合成基本途徑，雖然還不完善，但是為研究猴頭菌多糖合成相關關鍵基因和關鍵酶提供了借鑒。張楠等[22]通過新一代RNA測序技術獲得了6株猴頭菌的轉錄組，并研究了轉錄組的特征和生物活性化合物特別是多糖的生物合成，有助于研究猴頭菌中多糖的生物合成過程，為探索猴頭菌以及擔子菌門（Basidiomycota）其他成員的次生代謝物的相關基因提供有用的信息。猴頭菌多糖的生物合成途徑相對復雜，相關研究將成為未來猴頭菌多糖研究的最具潛力的方向。此外，陳娟等[14]檢測到在萜類骨架、二萜類、倍半萜類和多酮類生物合成過程中，有多種酶和大量的細胞色素P450蛋白參與，并通過基因組和轉錄分析揭示了猴頭菇中不同萜烯類和多酮類次生代謝物相關基因的調控差異。

1.3 功能基因定位

研究猴頭菌的功能基因是展示猴頭菌菌絲生長和代謝調控機制的重要途徑，也是優良新種育種和基因功能分析的相關方法。其中，猴頭菌的大多數重要農藝性狀如菌絲生長速度、酶活性以及產量等都是數量性狀，是由多個數量基因座位和外在環境因素共同控制的[23-24]。食用菌誘變育種均是以獲得優良農藝性狀為目標，常規方法難以實現數量性狀遺傳變異[25]。通過構建遺傳連鎖圖譜，尋找與數量性狀位點緊密連鎖的分子標記是數量基因座位的研究方法[26]。朱伶俐等[27]通過研究猴頭菌子實體4個生長發育時期后，篩選出最顯著的20條參與碳代謝、淀粉代謝和蔗糖代謝通路的相關基因，分析得到不同時期下的差異基因，初步定位多糖合成功能基因。

2 猴頭菌屬分子鑒定

2.1 基于常規PCR的分子標記技術

采用PCR方法的擴增檢測技術是藥材基源鑒定的快速檢測方法，其通過擴增條帶差異進行分子鑒定，具有分辨率高且無需測序出DNA序列信息等優點。目前應用于猴頭菌鑒定的分子標記主要有PFLP技術、RAPD技術、SRAP技術、IRAP技術和ISSR技術等。

PFLP技術是一種通過PCR技術擴增出一段特定的目標靶向片段后，繼而采用限制性內切酶統一處理的分子標記技術[28-29]，可以較為簡便、迅速的區分出不同的物種，屬于第一代分子標記[30-31]。曹鴻雁等[32]利用ITS序列及ITS-RFLP分析，分別對福建省食用菌種質資源庫保藏的猴頭菇及灰樹花、滑菇、黃傘、桑黃、姬松茸、蟲草、黑木耳和毛木耳8個近品進行了準確的鑒定分類，初步形成了各相關物種的鑒別方法。

RAPD是使用一段較短的隨機寡核苷酸序列引物擴增基因組的檢測技術，與RFLP技術類似，是第二代分子標記，可用于快速鑒定真核生物[33-34]。宋慧[35]采用該技術檢測各菌株基因組DNA在這些區域的多態性。Liu等[36]以猴頭菌液體和固體培養物為原料，證明采用RAPD和PCR技術結合的方式可以很好地篩選和鑒定猴頭菌的菌株。

SRAP分子標記技術即相關序列擴增多態性分子標記技術，具有重復性好、簡單操作、費用低廉等優點，該技術主要是對基因的編碼區進行擴增，定向分析基因的功能序列[37]。SRAP以其獨特的引物設計在基因組學上廣泛應用于分子遺傳圖譜的構建以及基因定位等方面[38-39]。劉麒等[40]建立了猴頭菌菌絲體基因組DNA的高效提取方法和SRAP標記體系，并利用SRAP標記對17個猴頭菌菌株進行了親緣關系分析和菌株鑒定，為菌株資源的鑒定、利用提供一定的研究基礎。

IRAP作為新型DNA分子標記技術，具有便捷、穩定擴增目標條帶的特點[36-37]。王俊等[10]分析了30余種栽培猴頭菌菌株種間遺傳差異，為猴頭菌道地性研究、種質資源鑒定、親緣關系研究和引種栽培提供了分子生物學依據。結果表明，34個猴頭菌菌株間均有遺傳上的差異，但遺傳相關性極高，同時表明我國猴頭菌栽培菌株間的遺傳背景較單一。

ISSR是在SSR技術原理上建立起來的一種分子標記技術，可以很好地反應出檢測物種的遺傳多樣性[38-39]。可用于快速實現對不同基源或不同基因類型猴頭菌的準確鑒定。楊爽[40]分析了65株猴頭菌的遺傳多樣性，結果顯示各個菌株在圖譜上都存在較強的特異性，所選用8個ISSR引物能將所有供試菌株相互區分開，并表現出豐富的遺傳多樣性。

2.2 DNA條形碼鑒定

隨著DNA條形碼體系的建立，常見真核生物的鑒定逐漸邁入基因鑒定時代。DNA條形碼鑒定技術是一種采用一段序列長度適宜、公認標準的DNA序列用于物種間鑒別的方法。DNA條形碼的特征常包含具有適當數目的特異性單核苷酸變異信息位點，實現對不同物種達到足夠的區分度[41-42]。通過運用這種簡單、易推廣的方法來鑒定物種以實現數據信息化最終達到資源共享，高效、準確鑒別物種的目的[43]。Chen等[44]提出ITS和ITS2均可作為植物和真菌的核心條形碼。王盼盼等[45]通過DNA條形碼技術，對所采集的包含猴頭菇在內的74種常見大型真菌進行了種屬水平的物種多樣性鑒定，將其鑒定為36屬、18科、6目、3綱，豐富了我國真菌的條形碼基因庫。皇甫永冠等[46]應用分子生物學方法進一步構建猴頭菇品種專屬的DNA條形碼，研究結果表明，該方法可以準確進行猴頭菌種間鑒定。基于條形碼構建系統發育進化樹的方法有多種，王俊等[10]分析表明，我國自然條件下采集得到的猴頭菌分3個種，即猴頭菌 （Hericium erinaceus）、珊瑚狀猴頭菌（Hericium coralloides） 和冷杉猴頭菌（Hericium abietis），其中猴頭菌與冷杉猴頭菌相互親緣關系較近，可有效區分猴頭菌菌種。

當前幾種運用于猴頭菌的分子鑒定方法各有優點和局限。各方法間的相互比較詳見表1。

表1 幾種分子鑒定方法的比較Tab.1 Comparison of several identification methods

3 展望

猴頭菌食藥兼用，是高營養價值的美味食用菌[52]。針對猴頭菌部分次生代謝物的生物活性及其種質資源多樣性已經進行了大量研究工作，如生物堿和多糖類具有多種生理活性，保健、抗腫瘤、調節免疫等。但研究的系統性仍然不足，特別是目前猴頭菇藥用成分與對應的調控基因之間的關聯還不清楚，對猴頭菌生長發育和藥用成分的決定性作用部位和研究機理尚不清楚，子實體和菌絲體品質控制難等問題，這極大地限制了猴頭菌的深度開發和利用[53-54]。分子生物學技術和功能基因的測序、復制以及定位技術的研究將對其有關品種的準確識別、產品的深度開發和相關種質資源多樣性研究注入新的活力[55]。

未來在猴頭菌的分子生物學研究方面，可進一步深入開展測序工作，將基因組、轉錄組、蛋白組和關鍵農藝性狀指標或藥學成分指標檢測相結合，基于跨組學整合策略開展猴頭菌活性成分累積機制研究及潛在調控元件篩選，挖掘出與關鍵農藝性狀或藥學成分指標相關的功能基因，為培育獲得高目標活性成分含量的猴頭菌菌株奠定理論基礎；探究不同生長階段猴頭菌的培養條件、藥用部位的異同，以及藥用成分的表達情況，測定代謝組以確定不同生長階段猴頭菌代謝物的種類及含量差異；通過分子標記技術，開展猴頭菌遺傳多樣性研究，確立可靠的形態分類特征與適合的DNA條形碼片段，對現有品種進行定型，為大型產業應用提供技術保障、為猴頭菌真菌資源的保護和利用提供科學依據；結合化學方法和物理手段，構建誘變育種相關方法，進行種質改良[56]；最后是菌絲體以及子實體不同生長時期猴頭菌多糖、多肽、生物堿、脂肪酸等藥用成分的表達和質量標志物成分的檢測以及對主要成分開發應用等方面開展綜合研究。