血漿外泌體HSP90α對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的價(jià)值探索

周嘉慧 陳思彤 劉海洲 韋文娥 張力圖

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發(fā)病率位于所有惡性腫瘤的第3位，死亡率則居于第2位，是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一［1］，其中肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高，預(yù)后差。因此，在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期診斷十分重要［2］。目前，在腫瘤診斷中，腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用已獲得共同認(rèn)可［3］。熱休克蛋白90α（HSP90α）是熱休克蛋白家族中的重要成員，和腫瘤有著密切關(guān)系［4］，近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)，其在結(jié)直腸癌臨床診斷上也具有重要指導(dǎo)意義［5］。最近，外泌體已成為研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和治療的明星結(jié)構(gòu)［6］。它是一種直徑約為40 nm～100 nm的微小膜泡，被膜結(jié)構(gòu)可以保護(hù)其內(nèi)含物（DNA，RNA和蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)）不受膜外的微環(huán)境中其他因子的影響從而處于較穩(wěn)定的狀態(tài)［7-8］。有研究證實(shí)血漿游離HSP90α可以從受損或死亡的細(xì)胞被動(dòng)釋放，而外泌體HSP90α可以從細(xì)胞中主動(dòng)釋放出來(lái)［9］，在腫瘤發(fā)展的過(guò)程中起促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移的作用［10］。目前，關(guān)于HSP90α在結(jié)直腸癌患者血漿外泌體中的表達(dá)及其臨床診斷價(jià)值尚無(wú)報(bào)道。本研究擬應(yīng)用超速離心法提取I～I(xiàn)II期原發(fā)性結(jié)直腸癌患者和結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的血漿外泌體，并應(yīng)用ELISA法檢測(cè)其HSP90α表達(dá)，與相同患者血漿游離HSP90α比較。探討結(jié)直腸癌患者的血漿外泌體HSP90α是否能作為肝轉(zhuǎn)移標(biāo)志物。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

隨機(jī)選取2017年11月至2020年4月于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收診的初治結(jié)直腸癌患者共54例，所有患者均具有完整的臨床和病理資料，采血前均未經(jīng)過(guò)放療、化療等治療，均未合并其他腫瘤和免疫系統(tǒng)疾病。患者術(shù)后分期按照AJCC第8版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)［11］進(jìn)行，其中原發(fā)性結(jié)直腸癌（pCRC）27例，男性12例，女性15例，年齡為36～86歲，平均（60.33±12.98）歲。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（CRLM）27例，男性20例，女性7例，年齡為36～76歲，平均（60.41±11.74）歲。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均自愿簽署知情同意書。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.標(biāo)本的采集：所有受檢者清晨空腹采集靜脈全血5 mL于EDTA-k2抗凝管內(nèi)，在室溫3 000 r/min離心15 min，吸取上層血漿用于游離HSP90α檢測(cè)和外泌體提取及檢測(cè)。

2.血漿外泌體的提取與鑒定：我們利用超速離心法對(duì)外泌體進(jìn)行分離，分離方法如下：取血漿樣本1 mL于離心管中，加入等體積PBS緩沖液稀釋。25℃條件下500×g離心10 min，取上清液，25℃條件下2 000×g離心10 min，小心吸取上清液，25℃條件下10 000×g離心30 min，轉(zhuǎn)移上清液于超高速離心專用離心管中，精確配平各離心管中的液體，4℃條件下100 000×g離心180 min，丟棄上清，所得沉淀即為外泌體，PBS重懸，-80℃凍存。

我們根據(jù)國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)（ISEV）的指導(dǎo)性文件［12］，從外泌體形態(tài)，粒徑大小和蛋白質(zhì)分子標(biāo)記這三方面驗(yàn)證所得外泌體。我們對(duì)提取的所有血漿外泌體樣本應(yīng)用納米顆粒追蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）鑒定外泌體的粒徑大小，隨機(jī)抽選兩例依次應(yīng)用透射電子顯微鏡（TEM）鑒定外泌體的形態(tài)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志物蛋白（CD9，TSG101）的表達(dá)情況。具體操作步驟照說(shuō)明書進(jìn)行。

3.HSP90α的檢測(cè)：采用HSP90α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（煙臺(tái)Protgen生物技術(shù)開發(fā)有限公司，中國(guó)煙臺(tái)）測(cè)定血漿游離HSP90α和外泌體HSP90α的水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究中所有定量數(shù)據(jù)均以中位數(shù)（極小值～極大值）表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。各組間血漿游離HSP90α和血漿外泌體HSP90α表達(dá)水平的比較均使用非參數(shù)檢驗(yàn)。影響因素的分析采用兩分類Logistic回歸模型。繪制ROC曲線。最佳截止值是通過(guò)使用與Youden指數(shù)最大值相對(duì)應(yīng)的量來(lái)確定的（Youden指數(shù)=敏感性+特異性-1）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、超速離心法提取的血漿外泌體符合外泌體標(biāo)準(zhǔn)

利用TEM觀察外泌體的形態(tài)及大小，結(jié)果顯示外泌體呈類圓形、茶托樣囊泡結(jié)構(gòu)，可見完整包膜，見圖1A。應(yīng)用Western blot對(duì)標(biāo)記蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩份樣品均表達(dá)CD9，TSG101，見圖1B。利用NTA對(duì)血漿外泌體的大小、濃度和分布進(jìn)行分析，結(jié)果顯示外泌體平均粒徑大小為109.8 nm，濃度為1.8×1010個(gè)/mL，見圖1C。

圖1 外泌體的鑒定。1A：外泌體在電鏡下的表現(xiàn)形態(tài)（100 nm大小比例尺）；1B外泌體表面標(biāo)記蛋白；1C：ZETAVIEW分析外泌體粒徑

二、血漿游離HSP90α和血漿外泌體HSP90α表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

不同性別，分化程度，CEA表達(dá)水平與CRC患者血漿外泌體HSP90α和血漿游離HSP90α表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），不同腫瘤部位血漿外泌體HSP90α差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=6.426，P＜0.05），其中右半結(jié)腸組表達(dá)水平最高。Ⅳ期CRLM患者血漿游離HSP90α和外泌體HSP90α表達(dá)水平明顯高于Ⅰ～Ⅲ期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=3.036，2.898；P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 結(jié)直腸癌患者血漿游離HSP90α和血漿外泌體HSP90α表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

三、血漿外泌體HSP90α與其他臨床指標(biāo)在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷中的比較

將血漿外泌體HSP90α、血漿游離HSP90α、CEA作為自變量，原發(fā)結(jié)直腸癌和結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移作為因變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示：血漿外泌體HSP90α、血漿游離HSP90α、CEA是診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表2。

表2 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

單項(xiàng)指標(biāo)的診斷效能分析顯示，CEA、血漿游離HSP90α、血漿外泌體HSP90α、均展現(xiàn)出了一定的診斷價(jià)值，血漿外泌體HSP90α結(jié)合CEA具有最高的診斷效能（AUC=0.861）。見表3。

表3 各指標(biāo)及聯(lián)合診斷對(duì)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷的ROC曲線分析結(jié)果

討 論

據(jù)報(bào)道結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者在未經(jīng)治療時(shí)的5年生存率低于5%，中位生存時(shí)間少于12個(gè)月，而早期完全切除肝轉(zhuǎn)移病灶后生存率可以增長(zhǎng)至30%～50%，中位生存期可以延長(zhǎng)至35個(gè)月［13］。因此，對(duì)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行早期診斷對(duì)提高患者生存率及改善預(yù)后來(lái)說(shuō)十分重要。HSP90α是一種細(xì)胞內(nèi)伴侶蛋白，越來(lái)越多的證據(jù)表明，HSP90α的高表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，如肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、食道癌、胰腺癌和淋巴瘤［14-16］。

外泌體分離和提取的方法有多種，超速離心法和試劑盒法是目前外泌體分離最常用的技術(shù)［17］，最優(yōu)分離方法尚無(wú)定論。超速離心法被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，但所需設(shè)備大，價(jià)格昂貴，且提取時(shí)間較長(zhǎng)，在高效性方面有一定的不足。本研究使用超速離心法提取血漿外泌體，并檢測(cè)HSP90α在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)血漿外泌體HSP90α在Ⅳ期肝轉(zhuǎn)移患者的表達(dá)水平明顯比Ⅰ～Ⅲ期更高（P＜0.05）。這說(shuō)明血漿外泌體HSP90α可用于診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移。由此可知，超離法雖然會(huì)造成外泌體的一定損失，但獲得純度較高的外泌體，在血漿外泌體HSP90α用于診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

本研究進(jìn)一步分析了結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者血漿外泌體HSP90α的表達(dá)水平與患者年齡、性別、分化程度、腫瘤部位及CEA表達(dá)水平等臨床病理特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)血漿外泌體HSP90α水平與年齡和腫瘤部位有關(guān)。采用最佳截?cái)嘀担獫{外泌體HSP90α表達(dá)水平對(duì)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的診斷具有較高的敏感性和特異性。

目前單一蛋白作為生物標(biāo)記物的敏感性和特異性都受到限制，因此，和其他研究［19-20］一樣，我們將CEA和我們目前研究的標(biāo)志物結(jié)合起來(lái)，以期達(dá)到更高的敏感度和特異度。從結(jié)果看，血漿外泌體HSP90α聯(lián)合CEA診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的AUC為0.861，敏感度為66.67%，特異度為92.59%。對(duì)照相同患者血漿游離HSP90α聯(lián)合CEA診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的AUC為0.830，敏感度為62.96%，特異度為96.3%，上述結(jié)果表明血漿外泌體HSP90α與CEA聯(lián)合檢測(cè)能夠進(jìn)一步提高結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的臨床檢出率。血漿外泌體HSP90α可以作為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的潛在新型腫瘤標(biāo)志物。

本研究還存在一定的不足，首先納入樣本數(shù)量較少，造成結(jié)果存在一定誤差。其次外泌體提取方法當(dāng)中超離法過(guò)于繁雜，其對(duì)臨床診斷的貢獻(xiàn)略顯不足，HSP90α檢測(cè)前外泌體提取方法的優(yōu)化是我們進(jìn)一步研究的內(nèi)容。并且我們的結(jié)果顯示單獨(dú)的血漿HSP90α診斷效能高于血漿外泌體HSP90α，后期我們會(huì)利用更精準(zhǔn)的方法并且優(yōu)化試劑盒的使用范圍以求更簡(jiǎn)便的提取血漿外泌體HSP90α。

綜上所述，本研究證實(shí)了血漿外泌體HSP90α可以作為診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的傳統(tǒng)標(biāo)志物的有效補(bǔ)充。