微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性研究

張冬生 封益飛 王勇 胥子瑋 唐俊偉 黃遠(yuǎn)健 張川 孫躍明

隨著我國居民生活方式的改變、飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整以及人口老齡化的進(jìn)展，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率、死亡率呈上升趨勢。目前，結(jié)直腸癌發(fā)病率占我國所有惡性腫瘤的第3位，死亡率占第5位，分別為28.20/10萬、13.61/10萬［1］。探究結(jié)直腸癌的病理分子特征，對患者的個體化診療具有重要意義。染色體不穩(wěn)定性（chromosomalinstability，CIN）（占80%～85%）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）（約占15%）是結(jié)直腸癌發(fā)生的兩條主要分子途徑［2］。MSI是由DNA錯配修復(fù)（mismatchrepair，MMR）基因突變或啟動子甲基化引起，錯配修復(fù)功能的缺失，造成基因組中短串聯(lián)重復(fù)序列的增加或減少，大量原癌基因或抑癌基因的突變不斷累積，導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)控失衡，最終造成腫瘤的發(fā)生。通常存在三種MSI狀態(tài)：高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability-high，MSIH）、低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instabilitylow，MSI-L）和微衛(wèi)星穩(wěn)定性（microsatellitestability，MSS）。MSI狀態(tài)對應(yīng)著較為特殊的臨床病理特征，與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后相關(guān)。本研究回顧性分析結(jié)直腸癌患者的臨床病理資料，探究MSI狀態(tài)與其臨床病理特征的相關(guān)性。

資料與方法

一、一般資料

采用回顧性隊列研究方法，收集2015年1月至2019年12月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸外科1 280例結(jié)直腸癌手術(shù)患者的臨床病理資料，其中男性800例，女性480例；中位年齡為63歲，年齡范圍為（26～91）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理檢驗確診為結(jié)直腸原發(fā)性腺癌；（2）接受結(jié)直腸癌根治術(shù)；（3）限期手術(shù)患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往腸癌病史、非R0切除、合并其他惡性腫瘤、多原發(fā)結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腫瘤家族史、闌尾腫瘤、肛管腫瘤、術(shù)前輔助放化療、炎癥性腸病患者。本研究符合《赫爾辛基宣言》的要求。

二、觀察指標(biāo)

1.人口學(xué)特征：性別、年齡、BMI、術(shù)前血清CEA及CA19-9水平。

2.手術(shù)標(biāo)本病理學(xué)檢查：腫瘤部位、TNM分期、T分期、N分期、M分期、腫瘤分化、印戒細(xì)胞、黏液分化、病理形態(tài)、腫瘤最大直徑、癌結(jié)節(jié)、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)檢出數(shù)、陽性淋巴結(jié)檢出數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率（陽性淋巴結(jié)檢出數(shù)/淋巴結(jié)檢出數(shù)）（lymph node ratio，LNR）。依據(jù)AJCC第8版結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行腫瘤分期。

3.MSI狀態(tài)。

三、PCR-毛細(xì)管電泳檢測MSI狀態(tài)

選取結(jié)直腸癌組織蠟塊進(jìn)行切片脫蠟提取DNA，采用MSI檢測試劑盒擴增結(jié)直腸癌組織中BAT25、BAT26、D5S346、D2S123及D17S250等5個Bethesda標(biāo)準(zhǔn)位點的突變狀態(tài)，當(dāng)癌組織存在2個及2個以上突變位點時判定為MSI-H，當(dāng)僅存在1個位點突變時判定為MSI-L，無位點存在突變則判定為MSS。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計數(shù)資料以絕對數(shù)或百分比表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗。等級資料采用秩和檢驗。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)M（P25，P75）表示，組間比較采用曼-惠特尼U檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料

1 280例患者中，右半結(jié)腸癌337例，左半結(jié)腸癌398例，直腸癌545例。TNM分期Ⅰ期215例，Ⅱ期649例，Ⅲ期359例，Ⅳ期57例。腹腔鏡手術(shù)969例，達(dá)芬奇手術(shù)153例，開放手術(shù)158例。112例（8.7%）為MSI-H，79例（6.2%）為MSI-L，1 089例（85.1%）為MSS。

二、MSI狀態(tài)與結(jié)直腸癌患者的臨床和病理特征的關(guān)系

MSI-H組患者CEA＜4.7ng/mL所占比例顯著高于MSS/MSI-L組患者（χ2=6.943，P＜0.05）（見表1）。MSI-H組與MSS/MSI-L組患者在腫瘤部位（Z=-9.451，＜0.001）、腫瘤TNM分期（Z=-2.108，P＜0.05）、腫瘤T分期（Z=-2.397，P＜0.05）、腫瘤N分期（Z=-3.892，＜0.001）、腫瘤分化（χ2=6.663，P＜0.05）、黏液成分 （χ2=78.833， ＜0.001）、腫瘤最大直徑（χ2=39.656，＜0.001）、癌結(jié)節(jié)（χ2=8.759，P＜0.05）、神經(jīng)侵犯（χ2=10.238，P＜0.05）、LNR（χ2=5.880，P＜0.05）、淋巴結(jié)檢出數(shù)（Z=-5.019，＜0.001）、陽性淋巴結(jié)檢出數(shù)（Z=-3.667，＜0.001）等方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義（見表2），主要表現(xiàn)為，MSI-H組患者右半結(jié)腸癌、低TNM分期、高T分期、低N分期、低分化、黏液成分、腫瘤直徑≥4cm、無癌結(jié)節(jié)、無神經(jīng)侵犯、低LNR所占比例顯著高于MSS/MSI-L組患者。MSI-H組患者淋巴結(jié)檢出數(shù)顯著多于MSS/MSI-L組，而陽性淋巴結(jié)檢出數(shù)顯著較少。

表1 MSI狀態(tài)與結(jié)直腸癌患者的臨床特征的關(guān)系［例（%）］

表2 MSI狀態(tài)與結(jié)直腸癌患者的病理特征的關(guān)系［例（%）］

續(xù)表

討 論

MSI-H狀態(tài)占散發(fā)性結(jié)直腸癌的10%～15%，遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌患者中，90%以上存在MSI-H狀態(tài)［3］。MSI狀態(tài)的檢測具有重要臨床意義。MSI檢測是林奇綜合征篩查的重要方法。對于Ⅱ期結(jié)直腸癌患者，MSI狀態(tài)直接決定其術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險及輔助治療的臨床決策。對于Ⅳ期結(jié)直腸癌患者，MSI狀態(tài)有助于篩查免疫檢查點抑制劑治療的適用人群。目前，MSI檢測已被美國國立綜合癌癥網(wǎng) 絡(luò) （National Comprehensive Cancer Network，NCCN）結(jié)直腸癌臨床實踐指南和中國臨床腫瘤學(xué)會（Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO）結(jié)直腸癌診療指南推薦用于所有結(jié)直腸癌患者［4］。

1998年美國國家癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）推薦對BAT25、BAT26、D5S346、D2S123和D17S250五個位點進(jìn)行檢測，根據(jù)微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定的數(shù)量將結(jié)直腸癌分為MSI-H（具有兩個或兩個以上位點改變）、MSI-L（僅有一個位點發(fā)生改變）以及MSS（沒有位點發(fā)生改變）［5］。PCR方法檢測微衛(wèi)星位點是最早確立的鑒別結(jié)直腸癌MSI狀態(tài)的方法，是當(dāng)前公認(rèn)的MSI檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。另一種常用方法是通過免疫組化（immunohistochemistry，IHC）檢測MMR基因編碼的蛋白，包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2，任一蛋白的表達(dá)缺失提示樣本為MSI-H，即為dMMR（deficient MMR），蛋白均表達(dá)陽性時則為MSS/MSI-L，即為pMMR（proficient MMR）。

MSI狀態(tài)與結(jié)直腸癌臨床分期具有一定的相關(guān)性，在Ⅱ期結(jié)直腸癌中，MSI-H/dMMR患者約占20%，在Ⅲ期結(jié)直腸癌中約占12%，而在Ⅳ期中最少，約占4%［6-7］。既往的研究表明與多數(shù)MSS/MSI-L/pMMR結(jié)直腸癌相比，MSI-H/dMMR結(jié)直腸癌具有較為特殊的臨床病理特征：（1）腫瘤原發(fā)部位多位于右半結(jié)腸；（2）女性多見；（3）分化程度較差；（4）黏液成分多見；（5）腫瘤邊緣呈膨脹性浸潤，T分期較晚，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumourinfiltrating lymphocytes，TILs）多見，周圍可見克羅恩病樣淋巴細(xì)胞反應(yīng)（Crohn's-like lymphoid reaction，CLR）；（6）區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較少；（7）同時發(fā)生BRAF突變較多，約占50%，而KRAS突變較少［6，8-12］。可見，MSI-H既有預(yù)后良好的，亦有預(yù)后不良的臨床病理特征。本研究結(jié)果顯示，MSI-H組患者CEA＜4.7 ng/mL、右半結(jié)腸癌、低TNM分期、高T分期、低N分期、低分化、黏液成分、腫瘤直徑≥4 cm、無癌結(jié)節(jié)、無神經(jīng)侵犯、低LNR所占比例顯著高于MSS/MSI-L組患者。MSI-H組淋巴結(jié)檢出數(shù)顯著多于MSS/MSI-L組，而陽性淋巴結(jié)檢出數(shù)顯著較少。MSI-H與MSS/MSI-L結(jié)直腸癌不同的臨床病理特征，提示二者的發(fā)生發(fā)展機制不同，對應(yīng)的治療策略可能不同。

淋巴結(jié)檢出數(shù)是結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本的重要病理指標(biāo)。除了手術(shù)切除范圍，淋巴結(jié)檢出數(shù)還受到病理檢查、患者自身以及腫瘤的生物學(xué)特征的影響。既往研究表明，MSI-H與更多的淋巴結(jié)檢出數(shù)相關(guān)，與本研究結(jié)果相一致。Kang等［13］通過對603例Ⅰ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者的資料分析發(fā)現(xiàn)，MSIH患者具有更多的淋巴結(jié)檢出數(shù)（中位數(shù)：31枚vs.23枚，P＜0.001）。Shin等［8］對245例Ⅱ/Ⅲ期結(jié)直腸癌患者的分析發(fā)現(xiàn)，MSI-H組淋巴結(jié)檢出數(shù)顯著多于MSS/MSI-L組（26.3±13.1枚vs.20.7±1.2枚，P=0.04）。Belt等［14］發(fā)現(xiàn)，65例MSI-H型結(jié)腸癌患者平均淋巴結(jié)檢出數(shù)10.1枚，267例MSS/MSI-L型患者為8.6枚（P=0.03），多因素分析顯示MSI狀態(tài)是高淋巴結(jié)檢出數(shù)的最強獨立影響因素。Berg等［15］回顧了204例Ⅰ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者的資料，發(fā)現(xiàn)79%（53/67例）的MSI-H患者具有足夠的淋巴結(jié)檢出數(shù)（≥12枚），MSS/MSI-L組為61%（83/137例）。多元線性回歸分析顯示MSI是淋巴結(jié)檢出數(shù)的獨立影響因素。由于DNA錯配修復(fù)功能的缺陷，MSI腫瘤中移碼突變所產(chǎn)生的截短肽鏈（truncated peptides）非常常見，其免疫原性誘導(dǎo)機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)增強，促使腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的大量出現(xiàn)［16］。此外，MSI-H結(jié)直腸癌具有一項重要病理特征－CLR，即瘤周淋巴細(xì)胞大量聚集成團(tuán)，星狀纖維包繞，部分具有生發(fā)中心［17］。CLR與更多、更大的淋巴結(jié)相關(guān)，預(yù)示著較好的預(yù)后［18］。抗腫瘤免疫反應(yīng)越強，淋巴組織增生，淋巴結(jié)越大，更加容易被發(fā)現(xiàn)［17，19］。MacQuarrie等［20］回顧分析了168例Ⅲ期結(jié)腸癌患者的病例資料，發(fā)現(xiàn)MSI患者與MSS患者平均淋巴結(jié)檢出數(shù)分別為15.9枚和16.9枚（P=0.664），認(rèn)為MSI狀態(tài)不影響淋巴結(jié)的檢出數(shù)目。然而，該研究時間跨度較大，可能存在較大的病例選擇偏倚，且未行多因素分析，其結(jié)論有待商榷［20］。

本研究作為單中心的回顧性研究，存在一定的選擇偏倚。然而，鑒于單中心研究中，手術(shù)切除標(biāo)準(zhǔn)、病理檢查標(biāo)準(zhǔn)可以得到統(tǒng)一，且本組病例數(shù)量較大，所得結(jié)論具有一定的臨床意義。

綜上所述，結(jié)直腸癌不同的MSI狀態(tài)具有特異性的臨床病理特征，MSI-H結(jié)直腸癌患者既有預(yù)后良好的，亦有預(yù)后不良的特征。MSI-H結(jié)直腸癌的特殊性，決定了其治療的個體化需求。