DAPK3和CDK8在宮頸癌組織中的表達及與預后的關系研究

魯自鑫 王 玉 王 莉

宮頸癌(cervical cancer)是婦科惡性腫瘤之一，發病率僅次于乳腺癌，近年來發病趨于年輕化，根據現有的醫療手段，其生存率和治療后復發率不容樂觀，嚴重威脅著女性的健康[1]。多項研究表明，人乳頭狀病病毒(human papillomavirus，HPV)的持續感染能極大的增加宮頸癌前病變、宮頸癌的發生，絕大部分宮頸癌患者存在HPV感染[2]。但是有學者研究表明，宮頸癌的危險因素除了HPV感染之外，抑癌基因的低表達也至關重要，表現為腫瘤細胞轉化過程中癌基因的激活和抑癌基因的失活了[3]。

DAPK3為1種抑癌基因，屬于死亡相關蛋白激酶DAPK 家族成員，與胃癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發生、發展、轉移有關，提高機體細胞的存活和增殖，增加機體對化療的抵抗力，DAPK3的低表達會引起降低腫瘤細胞細胞調亡進程，使腫瘤細胞的生存期延長[4]。CDK8是細胞周期依賴性蛋白激酶家族成員，可以促進腫瘤細胞的分裂和增殖，使腫瘤細胞周期的順利進行。

因此本研究通過檢測宮頸癌患者宮頸癌組織標本，探討DAPK3和CDK8在患者體內的表達情況，分析其與不同臨床特征的關系，為宮頸癌的診斷和預后指示提供輔助依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2020年1月就診于我院進行手術治療的68例宮頸癌患者為研究對象。本研究中所用的組織標本均為臨床診斷后的剩余標本，于手術過程中收集宮頸癌組織和癌旁正常組織，均為無壞死的新鮮組織，經甲醛固定、石蠟包埋切片后，進行免疫組織化學法檢測。患者年齡范圍為24～77歲，平均年齡為(49.45±13.74)歲，按FIGO分期標準，ⅠA～ⅠB1期 46例，ⅠB2～ⅡA期22例；高、中分化48例，低分化20例；宮頸鱗癌52例，腺癌16例；淋巴結轉移11例，無淋巴結轉移57例。患者及家屬均充分了解研究內容并簽署知情同意書，本研究已獲得醫院倫理委員會的準許。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①初次于我院進行治療，且既往無其他惡性腫瘤病史； ②經病理證實，腫瘤細胞類型均為腺癌或鱗癌；③術前未接受放化療、分子生物治療等；④半年內無心梗、腦梗等重大疾病。

排除標準：①患者為復發性宮頸癌；②合并其他惡性腫瘤；③心、肝、腎等臟器功能不全；④術前接受放化療、分子生物治療等特殊治療。

1.3 研究方法

1.3.1 主要試劑與儀器 DAPK3(Proteintech)，CDK8抗體(福建邁新)，免疫組化試劑盒(中杉金橋)，DAB Kit(中杉金橋，ZLI-9032)，蘇木精(中杉金橋，ZLI-9040)；病理切片機(德國Lecia公司)，組織芯片制備儀(北京博醫康實驗儀器有限公司)，低溫高速離心機(Thermo Scientific)，電子顯微鏡(日本Olympus公司)，醫用微波爐(Galanz)等。

1.3.2 免疫組織化學方法(IHC)步驟 所有病例均經手術和病理檢查等證實為宮頸癌。將術中采集宮頸癌組織切片進行二甲苯、梯度乙醇脫蠟、3%過氧化氫中封閉15 min消除內源性酶，經抗原修復后PBS緩沖液洗3次×5 min，滴加山羊血清封閉內源性生物素，加一抗(濕盒內4 ℃過夜存放)，PBS洗3次×5 min，加二抗(37 ℃避光孵育30 min)，PBS洗3次×5 min，加辣根酶標記卵酶鏈白素，PBS洗3次×5 min，DAB顯色10～60 s，水洗終止顯色，蘇木精復染40～60 s，經鹽酸酒精分化后，固定封片，鏡下觀察染色強度、評分。

1.3.3 染色評分標準 參照免疫組化結果評分系統(Dako，HercepTest Interpretation Manual)制定細胞核抗原半定量評價，鏡下觀察組織芯內陽性表達最顯著的區域，細胞核著色明顯為陽性。陽性細胞百分比評分：0分為陽性細胞數，1分為陽性細胞數<10%，2分為陽性細胞數11%～50%，3分為陽性細胞數51～75%，4分為陽性細胞數>75%。染色強度評分：0分為無染色，1分為輕度染色，2分為中度染色，3分為重度染色。表達強度=陽性細胞百分比評分×染色強度，0分為陰性，1～5分為低表達，6分及以上為高表達。

1.4 數據處理

以SPSS 19.0對數據進行分析，計數資料采用率(%)表示，計量資料使用 χ2檢驗，生存分析采用Cox回歸分析，P<0.05 為具有統計學意義。

2 結果

2.1 DAPK3和CDK8在宮頸組織中的表達

宮頸癌組織中DAPK3低表達率為98.53%(67/68)，顯著高于癌旁正常組織的8.82%(6/68)，CDK8在宮頸癌組織中的陽性表達率為92.65%(63/68)，顯著高于癌旁正常組織的10.29%(7/68)(P>0.05)。

2.2 DAPK3、CDK8與宮頸癌臨床特征的關系

不同年齡段、不同FIGO分期、不同組織學類型和分化程度宮頸癌患者DAPK3和CDK8的表達情況無統計學差異(P>0.05)，見表1。

表1 DAPK3、CDK8與不同臨床特征宮頸癌的關系(例，%)

2.3 DAPK3、CDK8表達與宮頸癌患者預后的關系

本研究中無進展生存時間平均為40個月，對DAPK3、CDK8表達情況和患者總生存及臨床病理參數進行分析，結果見表2所示。單因素回歸分析顯示，DAPK3(P=0.031)低表達較之高表達，CDK8(P=0.040)高表達較之低表達，顯著增加宮頸癌患者的死亡風險，FIGO分期為ⅠB2～ⅡA期(P=0.000)和低分化程度(P=0.028)也是患者死亡的風險因素。多因素回歸分析顯示，DAPK3低表達(P=0.004，HR=1.762，95%CI：1.189～2.483)、CDK8高表達(P=0.017，HR=1.688，95%CI：0.985～2.157)，與患者的不良預后密切相關，可作為獨立預測指標。

表2 宮頸癌組織標本單因素和多因素回歸分析

3 討論

宮頸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，據估計，每年約有50多萬的新發病例和27萬的死亡病例[5]。對于早期的宮頸癌，手術是首選治療方式，中晚期則以放化療為主，早期宮頸癌經治療后患者5年生存率為86.48%[6]，表明及早的治療能有效阻止腫瘤的進展，因此探索宮頸癌的分子診斷方法是很有必要的。

DAPK3屬于死亡相關蛋白激酶DAPK家族成員，參與細胞周期、增值、凋亡以及自噬的調控，為1種腫瘤抑制因子，在惡性腫瘤的發生發展中有重要作用[7-9]。DAPK3也參與了細胞有絲分裂、肌絲調節以及平滑肌細胞收縮等，其表達的缺失會降低細胞調亡進程，延長了惡性腫瘤細胞生存期，引起癌細胞增殖率的增加，提高了腫瘤細胞對化療的抵抗作用[10]。這與本研究中DAPK3在宮頸癌組織中的低表達狀態一致。宮頸癌由腫瘤細胞和間質構成，腫瘤組織中的血管在其生長擴散過程中有重要的作用[11]，CDK8可結合細胞周期蛋白，維持細胞周期的有序進行[12]。有學者研究表明，CDK8對宮頸癌的發生發展有促進作用，這與本研究結果類似。

本研究對宮頸癌患者宮頸癌組織和癌旁正常組織中DAPK3和CDK8表達水平進行檢測分析，顯示宮頸癌組織中DAPK3低表達率為98.53%，顯著高于癌旁正常組織的8.82%，CDK8在宮頸癌組織中的陽性表達率為92.65%，顯著高于癌旁正常組織的10.29%(P>0.05)。

臨床已有DAPK3在胃癌、前列腺癌等惡性腫瘤中表達量下調的報道，且DAPK3的下調與腫瘤分期、分化程度等存在一定的相關性[13-14]。在宮頸癌中，DAPK3下調可能與Hela細胞的增殖分化有關。本研究對宮頸癌患者DAPK3和CDK8表達情況與不同年齡、FIGO分期、組織學類型和分化程度的關系進行分析，結果表明不同年齡段、不同FIGO分期、不同組織學類型和分化程度的DAPK3和CDK8的表達情況無統計學差異(P>0.05)。

應用分子標志物輔助臨床分期和組織病理形態，為準確的預測預后和指導治療提供新的途徑。本研究中無進展生存時間平均為40個月，對DAPK3、CDK8表達情況和患者總生存及臨床病理參數進行分析，單因素回歸分析顯示，DAPK3(P=0.031)低表達較之高表達，CDK8(P=0.040)高表達較之低表達，顯著增加宮頸癌患者的死亡風險，FIGO分期為ⅠB2～ⅡA期(P=0.000)和低分化程度(P=0.028)也是患者死亡的風險因素。多因素回歸分析顯示，DAPK3低表達(P=0.004，HR=1.762，95%CI：1.189～2.483)、CDK8高表達(P=0.017，HR=1.688，95%CI：0.985～2.157)，與患者的不良預后密切相關，可作為獨立預測指標。

綜上所述，宮頸癌患者宮頸癌組織中DAPK3呈低表達狀態，CDK8呈高表達狀態，低水平的DAPK3和高水平的CDK8提示患者預后不良。