lncRNA ZFPM2-AS1在膀胱癌組織中的表達及對膀胱癌T24細胞生物學特性的影響

常俊鍇 侯俊清 朱朝陽 李曉東 李鐵強 徐衛波 趙小磊 徐文超

膀胱癌(bladder cancer，BC)是全世界最常見的泌尿科惡性腫瘤之一[1-2]。盡管膀胱癌患者接受了根治性膀胱切除術、放射療法以及術后化學或免疫療法，但他們的預后仍然很差[3]。由于高復發率和死亡率，迫切需要尋找用于診斷治療膀胱癌的新型分子生物標志物。長非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一種內源RNA，長度超過200 nt，無開放閱讀框(open reading frames，ORF)，因而lncRNAs無法編碼蛋白質，只能調節基因的表達[4]。越來越多的證據表明，lncRNAs參與了多種人類癌癥的發生和發展[5-7]。此外，lncRNAs可能是包括膀胱癌在內許多癌癥診斷和預后的潛在治療靶點和生物標志物[8-10]。鋅指蛋白多型2反義RNA 1(Zinc finger protein multitype 2 antisense RNA 1，ZFPM2-AS1)是位于8號染色體上的一種lncRNA[11]。Yan等[12]揭示了ZFPM2-AS1與肝細胞癌的進展有關。Kong等[13]研究表明ZFPM2-AS1通過抑制p53途徑促進胃癌進展。然而，ZFPM2-AS1在膀胱癌中的表達和作用尚未闡明。本研究將通過研究lncRNA ZFPM2-AS1在膀胱癌中的表達及其對膀胱癌細胞T24增殖、克隆形成、遷移和侵襲的影響，進一步揭示膀胱癌發生發展的分子機制，以期為膀胱癌診斷治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 胎牛血清、F12K、RPMI-1640、DMEM細胞培養基購自美國 Hyclone 公司；lncRNA ZFPM2-AS1引物、siRNA購自上海吉瑪生物制藥有限公司；Trizol、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒、2×SYBR Green Real time PCR Master Mix購自寶生物工程(大連)有限公司；放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒、MTT試劑盒、GAPDH抗體購自碧云天生物技術公司；Transwell小室購自美國康寧公司；p-β-catenin、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1購自美國 abcam公司，二抗購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 一般資料 收集2017年5月至2019年5月河南大學淮河醫院泌尿外科行手術切除治療的膀胱癌患者癌組織和癌旁組織樣本共102例，其中患者男性80例，女性22例；年齡32～76歲，平均年齡(43.7±17.1)歲；TNM分期Ⅰ～Ⅲ期42例，Ⅳ期60例。所有樣品在采集后立即冷凍保存在-80 ℃處，并經至少兩名病理醫生診斷為膀胱癌組織。所有患者術前未接受任何治療，都清楚地知道這些樣本將在將來使用，然后簽署知情同意書。本研究經倫理學委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1購自美國ATCC公司；膀胱癌細胞T24、J82和5637購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；SV-HUC-1細胞用含10%胎牛血清的F12K培養基培養，5637用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養，T24和J82細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養，所有細胞均置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中。

1.2.2 細胞轉染 取對數生長期T24細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達50%時，將3.3 μl的Lipofectmine 2000和陰性對照siRNA、lncRNA ZFPM2-AS1 siRNA兩種干擾序列與250 μl Opti-MEM混勻，室溫孵育15 min后加入細胞中，分別記為沉默對照組、沉默ZFPM2-AS1組，培養6 h后更換新鮮培養基，繼續培養至48 h后進行后續實驗研究。

1.2.3 qPCR檢測 利用TRIzol試劑盒提取膀胱癌組織樣本和細胞中總RNA，逆轉錄試劑盒進行反轉錄，2×SYBR Green Real time PCR Master Mix試劑盒檢測lncRNA ZFPM2-AS1表達，以GAPDH為內參。lncRNA ZFPM2-AS1正向引物：5'-CTA CTG CAG TGG GAG GCA AA-3'，反向引物:5'-AGG GGC ATT TAC CAC TGT GTG-3'；GAPDH正向引物：5'-TAT GAT GAT ATC AAG AGG GTA GT-3'，反向引物5'-TGT ATC CAA ACT CAT TGT CAT-3'。

1.2.4 細胞增殖檢測 取對數生長期各組T24細胞分別接種于96孔板中，密度為4×103個/孔，細胞培養24 h、48 h和72 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液繼續培養4 h，然后棄去上清液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，酶標儀震蕩10 min以溶解結晶并檢測490 nm處各孔吸光值。

1.2.5 細胞克隆形成實驗 取對數生長期各組T24細胞分別接種于6孔板中，密度為1×103個/孔，培養過程中每72 h更換一次培養基，培養12 d后，用甲醇固定細胞，結晶紫染色，顯微鏡下觀察并拍照，計數含有大于50個細胞的克隆數。

1.2.6 細胞劃痕實驗 取對數生長期各組T24細胞接種于6孔板中，培養過夜待細胞融合度達到90%時，用無菌200 μl槍頭進行劃痕，后吸棄上清，PBS洗去漂浮細胞，加入無血清培養基并在顯微鏡下拍照，此時記為0 h，繼續培養48 h后取出拍照，此時記為48 h。劃痕閉合率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.7 細胞侵襲實驗 取預鋪基質膠的Transwell小室置于24孔板中，每孔加入50 μl無血清培養基潤化30 min，后取2組5×104個對數生長期T24細胞接種至上室中，下室中加600 μl完全培養基，每組設置3個復孔。培養48 h后，棄上清，PBS洗滌2次，用甲醇固定細胞，結晶紫染色，顯微鏡下觀察并拍照，計數各組侵襲細胞數。

1.2.8 Western blot檢測 RIPA裂解液提取2組對數生長期T24細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取適量蛋白用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel-electrophoresis，SDS-PAGE)電泳分離并轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別用β-catenin、p-β-catenin、c-Myc、Cyclin D1和GAPDH一抗稀釋液于4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后，二抗稀釋液室溫孵育2 h，后經TBST洗滌后用ECL發光液孵育條帶并置于化學發光成像系統中進行曝光顯影，Image J軟件分析各個蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 膀胱癌組織及膀胱癌細胞中lncRNA ZFPM2-AS1的表達

qPCR檢測102對膀胱癌組織樣本和膀胱癌細胞系中lncRNA ZFPM2-AS1表達結果顯示，膀胱癌組織中lncRNA ZFPM2-AS1表達(4.92±3.85)高于癌旁組織(1.83±1.29)，膀胱癌細胞T24、J82和5637細胞中lncRNA ZFPM2-AS1表達(5.92±0.62、3.02±0.34、4.85±0.61)高于正常膀胱上皮細胞(1.02±0.10)，差異均有統計學意義(t=7.686、13.514、9.775、10.732，P<0.01)。

2.2 沉默T24細胞中lncRNA ZFPM2-AS1的表達

qPCR檢測結果顯示，沉默ZFPM2-AS1組T24細胞中lncRNA ZFPM2-AS1表達水平(0.14±0.02)低于沉默對照組(0.98±0.09)，差異有統計學意義(t=15.781，P=0.003)。

2.3 沉默lncRNA ZFPM2-AS1對膀胱癌細胞T24增殖的影響

MTT檢測結果顯示，48、72 h時沉默ZFPM2-AS1組T24細胞相對吸光度值較沉默對照組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，表明沉默lncRNA ZFPM2-AS1可顯著抑制膀胱癌細胞T24增殖。見表1。

表1 沉默lncRNA ZFPM2-AS1后T24細胞相對吸光度值變化

2.4 沉默lncRNA ZFPM2-AS1對膀胱癌細胞T24克隆形成的影響

沉默ZFPM2-AS1組T24細胞克隆數(97.54±19.64)較沉默對照組(257.57±46.25)明顯減少，差異有統計學意義(t=5.516，P=0.015)。見圖1。

圖1 沉默lncRNA ZFPM2-AS1抑制T24細胞克隆形成

2.5 沉默lncRNA ZFPM2-AS1對膀胱癌細胞T24遷移的影響

沉默ZFPM2-AS1組T24細胞劃痕閉合率[(33.19±3.89)%]較沉默對照組[(61.35±6.87)%]明顯減少，差異有統計學意義(t=6.178，P=0.007)。見圖2。

圖2 沉默lncRNA ZFPM2-AS1抑制T24細胞遷移(×100)

2.6 沉默lncRNA ZFPM2-AS1對膀胱癌細胞T24遷移的影響

沉默ZFPM2-AS1組T24細胞侵襲細胞數(41.43±9.85)較沉默對照組(152.39±15.71)明顯降低，差異有統計學意義(t=10.365，P=0.001)。見圖3。

圖3 沉默lncRNA ZFPM2-AS1抑制T24細胞侵襲(×100)

2.7 沉默lncRNA ZFPM2-AS1對膀胱癌細胞T24中Wnt/β-catenin信號通路的影響

沉默對照組T24細胞中p-β-catenin、β-catenin及其下游蛋白c-Myc和Cyclin D1蛋白相對表達量分別為0.48±0.05、1.14±0.11、0.68±0.07和0.56±0.06；沉默ZFPM2-AS1組T24細胞中p-β-catenin、β-catenin、c-Myc和Cyclin D1蛋白相對表達量分別為1.18±0.13、0.44±0.05、0.24±0.02和0.36±0.04。與沉默對照組比較，沉默ZFPM2-AS1組T24細胞中β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表達明顯降低，p-β-catenin蛋白表達顯著增加，差異均有統計學意義(t=10.034、10.468、4.804、8.705，P<0.01)。見圖 4。

圖4 Western blot檢測沉默lncRNA ZFPM2-AS1后T24細胞中Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達

3 討論

膀胱癌是全世界泌尿系統常見的癌癥之一[14]。據2015年中國癌癥統計顯示，膀胱癌的死亡率和發病率在泌尿系統惡性腫瘤中排名第一，診斷出約80500例新病例，并導致約32900例死亡[15]。與前列腺癌不同，膀胱癌仍然缺乏可靠的腫瘤生物標志物[16]。即使進行全身治療，仍有高達45%的膀胱癌患者會復發，并且膀胱癌的5年生存率還不到50%[1,17]。因此，有必要發現新的分子生物學標志物來預測臨床進展和不良預后，并闡明膀胱癌發展和進展的分子機制以開發新的治療靶標。

長非編碼RNA(lncRNA)的研究進展可能為癌癥研究人員提供新的思路。lncRNA是無法翻譯成蛋白質的一組RNA，lncRNA占轉錄組的98%以上，與細胞的一系列生物學功能密切相關[18-19]。研究發現，lncRNA的失調與各種癌癥的發生和發展密切相關。例如，有研究發現TINCR可抑制肺癌細胞增殖和侵襲；MCM3AP-AS1可促進肝細胞癌進展，此外，ZFAS1可以促進膀胱癌的發生[20-22]。ZFPM2-AS1是一種尚未引起廣泛關注的新型lncRNA。最近的一項研究證明，ZFPM2-AS1可通過減弱p53途徑促進胃癌的進展[13]。lncRNA ZFPM2-AS1可作為ceRNA通過調控miR-18b-5p/VMA21和miR-511-3p/AFF4通路參與肺腺癌進展[23-24]。此外，Liu等研究表明，ZFPM2-AS1在腎細胞癌標本和細胞中明顯上調，且與腎癌患者的腫瘤分期、淋巴結轉移及預后密切相關；過表達ZFPM2-AS1可顯著促進腎癌細胞生長、遷移和侵襲[25]。上述結果表明，ZFPM2-AS1促進了多種腫瘤發生進展，可能是癌基因，然而，其在膀胱癌中的表達和作用仍不清楚。本研究通過qPCR檢測發現，lncRNA ZFPM2-AS1在膀胱癌組織和細胞中高表達，沉默其表達能夠顯著抑制膀胱癌細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲，提示lncRNA ZFPM2-AS1在膀胱癌中是一個潛在的致癌基因。

Wnt/β-catenin信號通路是人類腫瘤中最常見的致癌信號通路之一[26]。據報道，一些lncRNAs在包括膀胱癌在內的多種癌癥中可調控Wnt/β-catenin信號通路轉導。例如，長鏈非編碼RNA XIST通過調節miR-139-5p介導的Wnt/β-catenin信號通路來促進膀胱癌細胞生長和轉移[27]。本研究發現，沉默lncRNA ZFPM2-AS1可顯著抑制膀胱癌細胞T24中Wnt/β-catenin信號通路蛋白β-catenin及其下游蛋白c-Myc和Cyclin D1表達，上調p-β-catenin表達，表明lncRNA ZFPM2-AS1通過調節Wnt/β-catenin信號傳導途徑的激活在膀胱癌細胞中發揮致癌作用。

綜上所述，LncRNA ZFPM2-AS1在膀胱癌中高表達，沉默其表達能夠抑制膀胱癌細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲，其機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關，提示lncRNA ZFPM2-AS1可能作為膀胱癌患者的新型潛在治療靶標和預后生物標志物。