BEX2介導細胞自噬通路與小鼠結腸癌的分級、療效及預后的相關性

谷雅川 孫雪花 宋立云

結腸癌(colorectal cancer,CRC)作為消化道常見的惡性腫瘤，在全球各個國家均具有較高的發病率和病死率。結腸癌患者的治療和預后直接受到結腸癌細胞的增殖、浸潤以及轉移侵襲的影響[1-2]，因此，盡早的診斷出結腸癌細胞轉移、侵襲，從而針對性地進行預防、治療結腸癌，可改善患者預后[3-4]。本研究通過檢測 BEX2介導細胞自噬通路在小鼠結腸癌細胞中的表達情況，并分析結腸癌轉移、侵襲與BEX2的相關性，并評價其介導細胞自噬通路與小鼠結腸癌的分級、療效及預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 小鼠結腸癌模型構建

選取60只SD小鼠，均進行二甲肼頸背部皮下注射，注射頻率1次/周，連續5周，建立結腸癌小鼠模型，并給予奧沙利鉑15 mg/kg，腹腔注射，每周2次，連續給藥8周。

1.2 免疫組化檢測

將小鼠病理切片標本取出，用含有5%血清的室溫封閉40 min，然后在4 ℃情況下加入單克隆抗體BEX2、LC3-Ⅱ和堿性磷酸酶二抗孵育。利用PBS清洗再加入SP，和DAB恒溫顯色封片。BEX2、LC3-Ⅱ的主要陽性表達細胞占計數細胞百分率≤10為陰性表達；>10為陽性表達。

1.3 Real-Time PCR檢測方法

小鼠結腸癌細胞中的LC3-Ⅱ以及BEX2mRNA表達采用Real-time PCR法檢測。取相對定量法以及閾值循環數(cycle threshold,CT)值比較法，算出不同樣本間LC3-Ⅱ、BEX2、mRNA相對百分比。

1.4 WesternBlot檢測方法

將小鼠結腸癌組織收集后再提取蛋白，測定蛋白的濃度。然后利用10%聚丙烯酰胺凝膠將不同組別的蛋白樣品進行電泳并轉至PVDF膜上，采用脫脂奶粉對PVDF膜進行40 min封閉，加入LC3-Ⅱ、BEX2一抗過夜。1天后取出PVDF膜，用TBST洗膜，再加入二抗孵育60 min。用TBST洗膜2次。最后加入ECL顯色液顯色，掃描各泳道條帶的灰度，利用軟件計算其對應的蛋白表達量。

1.5 統計學分析

用SPSS 22.0軟件處理本實驗的數據結果，計數資料以率(%)表示，采用χ2檢驗進行組間比較。以P<0.05為標準，說明數據比較具有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果

正常組織BEX2的陽性率為18.33%(11/60)，而結腸癌組織中則為75.00%(45/60)，結腸癌組織中表達較正常組織明顯上升(χ2=38.71,P<0.05)。LC3-Ⅱ在結腸癌組織及正常組織中的陽性率分別為26.67%(16/60 )和66.67%(40/60)，結腸癌組織中LC3-Ⅱ的表達明顯較正常組織下降(χ2=19.29,P<0.05)。小鼠治療后的結腸癌組織中的平均BEX2光密度明顯較治療前下降；而平均LC3-Ⅱ光密度明顯較治療前升高(P<0.05)。見表1。

表1 免疫組化蛋白光密度檢測結果

2.2 Real-Time PCR檢測BEX2和LC3-Ⅱ mRNA結果

小鼠結腸癌組織中的BEX2 mRNA表達較正常結腸組織顯著升高，而LC3-Ⅱ mRNA表達含量顯著降低(P<0.05)。小鼠治療后的結腸癌組織中的BEX2 mRNA表達量明顯較治療前下降；而LC3-Ⅱ mRNA表達量明顯較治療前升高(P<0.05)。見表2。

表2 Real-Time PCR檢測結果

2.3 WesternBlot檢測BEX2和LC3-Ⅱ蛋白含量結果

小鼠結腸癌組織中的BEX2蛋白表達較正常結腸組織顯著升高，而LC3-Ⅱ蛋白表達含量顯著降低(P<0.05)。小鼠治療后的結腸癌組織中的BEX2蛋白表達量明顯較治療前下降；而LC3-Ⅱ蛋白量明顯較治療前升高(P<0.05)。見表3。

表3 WesternBlot檢測結果

2.4 BEX2和LC3-Ⅱ與結腸癌臨床特征、療效和預后的相關性

LC3-Ⅱ以及BEX2的陽性表達與結腸癌的浸潤深度、淋巴結轉移、分化程度、Dukes分期、是否遠處轉移以及TNM分期呈現顯著相關性 (P<0.05)。見表4。

表4 BEX2和LC3-Ⅱ與結腸癌侵襲轉移的相關性/只

3 討論

BEX2 作為BEX家族的成員，主要發揮著調節細胞的轉錄、增殖等信號通路的作用[5-6]。近年來，越來越多的研究證明了BEX2與腫瘤發生具有相當密切的關系，且在不同類型的腫瘤中發揮的作用并不相同。目前，關于結直腸癌組織中BEX2發揮何種功能尚未見報道。深入分析BEX2在結直腸癌中作用機制不僅能夠進一步了解結直腸癌發生、發展生物學特征，亦可為結直腸癌患者治療提供新的靶點。有證據表明BEX2可以抑制線粒體凋亡。BEX2的表達與結直腸癌的TNM分期呈正相關，有實驗證實過表達BEX2可通過NF-kB信號通路增強腫瘤細胞的增殖能力和侵襲，克隆形成能力和致瘤能力，抑制BEX2表達在體外和體內都能抑制腫瘤的生長[7-8]。細胞的自噬類似于細胞衰老、凋亡，作為細胞生命周期中的重要生物學環節之一，該過程在生物的生長、發育過程中普遍存在。異常的細胞自噬現象會造成癌細胞的發生。自噬是一種所謂的“自噬”細胞機制，它涉及清除錯誤折疊的蛋白質，防止錯誤折疊的蛋白質和受損細胞器的毒性積累，并通過實現細胞的新陳代謝需求來實現自我吞噬[9-10]。最近的研究表明，不同類型的癌細胞在抗癌治療后會經歷自噬，與腫瘤的發生發展密切相關[11]。因此，由BEX2介導自噬現象越來越受到人們的關注。

本研究結果表明，BEX2在結腸癌組織及正常組織中的陽性率分別為75.00%(45/60)和18.33%(11/60)，BEX2在結腸癌的表達明顯高于正常組織(P<0.05)。小鼠治療后的結腸癌組織中的平均BEX2光密度、BEX2蛋白和mRNA表達量均明顯較治療前下降(P<0.05)。說明，BEX2可調節細胞生長傳遞持續性促有絲分裂信號，導致腫瘤細胞不斷增殖和分裂。BEX2的陽性表達和結腸癌的浸潤深度、淋巴結轉移、分化程度、Dukes分期、是否遠處轉移以及TNM分期相關性顯著(P<0.05)，說明BEX2異常高表達和腫瘤的浸潤、分期、轉移以及治療預后等行為密切相關。LC3-Ⅱ基因是介導細胞自噬的主要蛋白，參與調節細胞自噬的過程，并介導細胞凋亡的發生。本研究結果表明，LC3-Ⅱ在結腸癌組織及正常組織中的陽性率分別為66.67%(40/60)和26.67%(16/60)，LC3-Ⅱ在結腸癌的表達明顯低于正常組織，說明LC3-Ⅱ表達的降低或突變與腫瘤浸潤、轉移和不良預后密切相關。說明自噬可能是在腫瘤進展的早期阻礙腫瘤發生，自噬的缺陷會損傷細胞內環境維持穩定的能力，從而活化癌基因，讓抑癌基因失活，細胞中積累了大量的衰老細胞器，從而將正常細胞轉變為不正常的癌細胞。本研究結果顯示LC3-Ⅱ和小鼠結腸癌浸潤深度、分化程度、是否發生遠處轉移以及淋巴結轉移關系密切，說明浸潤深、高分化、發生淋巴結轉移及遠處轉移的結腸癌患者 LC3-Ⅱ 表達異常升高。

小鼠結腸癌組織中BEX2、LC3-Ⅱ異常表達與腫瘤轉移密切相關，可作為預測結腸癌分級、療效及預后的分子生物學靶點。