海金沙中非法添加檸檬黃的快速鑒別研究

王 康，郭 舟，張 勤，陳建玲，吳 競

（湖北省襄陽市公共檢驗檢測中心，湖北 襄陽 441004）

海金沙為海金沙科植物海金沙Lygodium japonicum（Thunb.）Sw. 的干燥成熟孢子，有清利濕熱、通淋止痛功效，主要用于熱淋、膏淋、血淋、石淋、尿道澀痛等的治療［1］。海金沙由于藥用部位的特殊性，采收難，產量低，市場需求較大，導致其價格不斷上漲，由于利潤的驅使和市場監管不到位等原因，市場上部分海金沙藥材長期存在雜質過多、摻泥沙或其他物質增重等質量問題［2-3］。近年來，全國中藥材及飲片質量分析報告和湖北省藥品質量公告中，不合格批次較多的中藥材、飲片中屢屢出現海金沙，不合格項目主要為性狀、顯微鑒別和總灰分［4-6］。2019 年5 月至2020 年6 月，湖北省襄陽市藥品監督抽檢過程中對部分海金沙藥材樣品進行薄層色譜鑒別時，發現其甲醇溶液呈顯著黃色，疑似非法添加了水溶性色素檸檬黃。由于2015 年版《中國藥典（一部）》海金沙項下無色素檢查項，相關的補充檢驗方法也處于空白狀態；同時，海金沙中非法添加檸檬黃色素也未見類似報道。本研究中采用水試法進行初篩、薄層色譜鑒別檢查是否非法添加檸檬黃，并采用高效液相色譜法和紫外-可見分光光度法進行驗證?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀，包括SPD-M20A 型二極管陣列檢測器（日本Shimadzu 公司）；ZY-600U 型薄層色譜自動成像分析系統（北京先驅威鋒技術開發公司）；XS205 型電子天平（精度為0.01 mg）、AL204 型電子天平（精度為0.1 mg），均購自瑞士梅特勒-托利多公司；HU-6150B 型超聲波清洗器（天津恒高電氣科技有限公司）。

1.2 試藥

檸檬黃對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為510004-202003，含量為93.4%）；硅膠G 板（青島海洋化工有限公司）；海金沙藥材9 批（來源見表1）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

表1 海金沙藥材來源Tab.1 Source of Lygodii Spora

2 方法與結果

2.1 水試法初篩

取藥材樣品1 ～9 號各5 g，分別置50 mL 燒杯中，加水40 mL，攪拌5 min，靜置10 min，濾過，取續濾液，得供試品溶液。另取檸檬黃對照品適量，同法制備對照品溶液。上述溶液各取20 mL，置25 mL 納氏比色管中，同置白色背景前，在自然光下平視觀察，結果藥材樣品5、樣品6 供試品溶液呈現與對照品溶液類似且顯著的黃色，初步判斷可能非法添加了色素檸檬黃。詳見圖1。

1-9. 供試品溶液 S. 對照品溶液圖1 水試法比色圖1 -9. Test solution S.Reference solutionFig.1 Colorimetric picture of aqueous solution test

2.2 薄層色譜法檢查

取藥材樣品1 ～9 號各5 g，分別加70%乙醇40 mL，超聲（150 W，40 kHz，下同）處理20 min，離心，取上清液，得供試品溶液。另取檸檬黃對照品適量，加70%乙醇，制成質量濃度為0.1 mg／mL 的對照品溶液。照2015 年版《中國藥典（四部）》通則0502“薄層色譜法”試驗，吸取各供試品溶液和對照品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水-水（1 ∶3 ∶3 ∶1 ∶1，V／ V／ V／ V／ V）為展開劑，二次展開，取出，晾干，在可見光下檢視。結果見圖2。藥材樣品5、樣品6 供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同的黃色斑點，故判斷藥材中非法添加了色素檸檬黃。

1-9. 供試品溶液 S. 對照品溶液圖2 薄層色譜圖1 -9. Test solution S.Reference solutionFig.2 TLC chromatograms

2.3 驗證試驗

2.3.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent Eclipse XDB -C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A） -0.05 mol／L 乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0 ～30 min 時5%A→45%A，30 ～40 min 時45%A→5%A，40 ～45 min 時5%A）；流速：1.0mL／min；檢測波長：432nm；柱溫：35℃；進樣量：10μL。

2.3.2 溶液制備

取檸檬黃對照品適量，加70%乙醇制成每1 mL 約含10 μg 的對照品溶液。取高度懷疑非法添加了檸檬黃的藥材樣品5，6 各5 g，分別加70%乙醇40 mL，超聲處理20 min，離心，取上清液，得供試品溶液。取確定未添加檸檬黃的樣品，同法制備陰性對照品溶液。

2.3.3 測定法

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，應不得出現與對照品溶液色譜相同保留時間處的色譜峰；若出現，則采用紫外-可見分光光度法比較色譜峰在190 ～760 nm 波長范圍內光譜的吸光度，吸光度應不相同。

2.3.4 結果判定

依法測定，結果見圖3 和圖4。樣品5、樣品6 供試品溶液色譜中，均與對照品溶液相應色譜保留時間完全相同，相應的光譜圖也完全相同，而陰性對照品溶液則無相應色譜峰。結果確證樣品5、樣品6 均添加了色素檸檬黃。

3 討論

2018 年8 月，全國范圍內開展中藥飲片質量集中整治后，中藥飲片的質量有很大改善，但仍存在極少部分中藥材染色現象［5-6］。文獻報道發現有染色問題的中藥品種涉及延胡索［7］、蒲黃［8-9］、黃連［8，10］、西紅花［11］、紅花［12］、丹參［13］、黃芩［14］等，主要采用薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜聯用法對藥材中的人工合成色素進行定性及定量檢測［15-16］。

1. 檸檬黃A. 對照品溶液 B. 藥材樣品5 供試品溶液 C. 藥材樣品6 供試品溶液 D. 陰性對照品溶液圖3 高效液相色譜圖1.lemon yellowA.Reference solution B.Test solution of sample Ⅴ C.Test solution of sample Ⅵ D.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

A. 對照品溶液 B. 藥材樣品5 供試品溶液 C. 藥材樣品6 供試品溶液圖4 紫外-可見吸收光譜圖A. Reference solution B.Test solution of sample Ⅴ C. Test solution of sample ⅥFig.4 UV-Vis absorption spectrograms

本研究中對海金沙采用水試法進行色素檢查初篩，該經驗鑒別法具有操作簡單、快速、結果易判斷的特點，對于判斷海金沙是否非法添加水溶性色素檸檬黃有很好的參考價值，可在藥品監督檢驗中更高效地發揮快速初篩作用。初篩陽性樣品需通過薄層色譜法進行進一步檢查，其操作簡單，試驗成本低，但同時檢測多種色素時分離度較差，易出現假陽性干擾，且靈敏度較低，不能作為確證方法。高效液相色譜法可利用色譜峰的保留時間和紫外-可見吸收光譜圖進行定性判斷，具有專屬性強、靈敏度高、分離度好的特點，可用于檸檬黃的定性確證和定量分析。

經國家藥品監督管理局批準的補充檢驗方法是非法添加色素監督檢驗的重要依據，是中藥材染色問題監管的重要科學手段。各級食品藥品檢驗機構在最近10 年的監督抽驗中，通過應用經批準的補充檢驗方法，檢出大批量的摻假染色中藥材，有力打擊了中藥材非法添加的違法行為。鑒于海金沙尚無相關色素非法添加的檢驗方法，本研究中建立的海金沙中檸檬黃的快速檢測方法，操作簡單、快速、準確，可用于申報海金沙中檸檬黃檢查的補充檢驗方法。