高效液相色譜法測定腦心舒口服液中雜質5-羥甲基糠醛含量

李 玲，吳 琦，王婷婷

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222006）

腦心舒口服液主要成分為蜜環(huán)菌濃縮液、蜂王漿，輔料為蜂蜜、香精、苯甲酸鈉，具有滋補強壯、鎮(zhèn)靜安神功效［1］。其質量標準收載于《衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑（第二十冊）》［1］，標準中無雜質5-羥甲基糠醛（5-HMF）的檢查項。蜂蜜作為矯味劑（用量為45%）添加到制劑中，蜂蜜中果糖和葡萄糖的總量不少于60%［2］。5-HMF 是由葡萄糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下脫水生成的醛類化合物，腦心舒口服液在制備過程包括將蜂蜜在90 ～100 ℃下加熱煉制環(huán)節(jié)［1］，故極易降解出雜質5-HMF。5-HMF 為第2 類基因毒性雜質［3］，對人體有致敏性、致癌性、神經(jīng)毒性、基因毒性等副作用［3-6］。雜質尤其是基因毒性雜質作為影響藥品安全性的關鍵因素，目前已成為藥品評價和研究的重點［7］。本試驗中建立了測定腦心舒口服液中5-HMF 含量的高效液相色譜法，旨在為制劑的質量控制和質量標準提高提供參考。現(xiàn)報道如下。

1.5-羥甲基糠醛A. 對照品溶液 B. 供試品溶液 C. 陰性對照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.5 -hydroxymethylfurfuralA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜儀，包括Empower 軟件（美國Waters 公司）；KH-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；BP211D 型十萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司）。

1.2 試藥

5 -HMF 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111626-201912，含量為99.2%）；腦心舒口服液（市售中藥制劑）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～13 min 時10%A，13 ～14 min 時10%A→80%A，14 ～20 min 時80%A，20 ～21 min 時80%A→10%A，21～30min 時10%A）；流速：1.0mL／min；檢測波長：284nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取5-HMF 對照品適量，精密稱定，加甲醇-水（1 ∶1，V／ V）制成每1 mL 含5-HMF 102.2 μg的對照品貯備液；精密吸取2 mL，置20 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1 ∶1，V／ V）定容，搖勻，制成每1 mL 含5-HMF 10.22 μg 的對照品溶液。

供試品溶液：精密量取樣品1 mL，置20 mL 容量瓶中，加甲醇-水（1 ∶1，V ／ V）超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理，并定容，搖勻，濾過，即得。

陰性對照品溶液：按腦心舒口服液處方和工藝制備不含蜂蜜的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果理論板數(shù)按5-HMF 峰計應不低于3 000，陰性對照品溶液色譜中，在與5-HMF 對照品溶液色譜相應保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖1。

線性關系考察：分別精密量取2.2 項下5-HMF 對照 品 貯 備 液0.04，0.20，1.00，2.00，4.00，10.00，15.00 mL，分別置20 mL 容量瓶中，加甲醇-水（1 ∶1，V／ V）定容，搖勻，制成系列對照品溶液。精密量取20 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以5-HMF 質量濃度（μg／mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝142 764X-32 163，r＝0.999 7（n＝7）。結 果 表 明，5-HMF 質 量 濃 度 在0.204 ～76.65 μg／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

定量限、檢測限考察：將對照品溶液逐級稀釋，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S／ N）10 ∶1，3 ∶1分別計算定量限和檢測限。結果定量限和檢測限分別為0.21，0.07 μg／mL。

精密度試驗：取2.2 項下對照品溶液，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結果5-HMF 峰面積的RSD為0.37%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為200208）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，6，12，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果5-HMF 峰面積的RSD為1.16%（n ＝6），表明供試品溶液在室溫下24 h 內穩(wěn)定。

重復性試驗：取樣品（批號為200208）適量，平行6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，并計算含量。結果5-HMF 峰面積的RSD為1.75%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品（批號為200208）0.5 mL，共9 份，分別加入低、中、高質量濃度對照品溶液，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n ＝9）Tab.1 Results of the recovery tests（n ＝9）

2.4 樣品含量測定

取12 批樣品各適量，分別按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品中5-HMF 的含量。結果見表2。

表2 樣品信息及5 -HMF 含量測定結果（mg／mL，n ＝12）Tab.2 The information of the samples and the results of content determination of 5 -HMF in the samples（mg／mL，n ＝12）

3 討論

預試驗中，對甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.01%磷酸溶液、甲醇-0.05%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等流動相體系進行對比考察，并對不同梯度洗脫比例進行摸索，最終確定采用甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相，進行梯度洗脫。在此色譜條件下，5-HMF 峰形對稱，理論板數(shù)最佳，并能與相鄰成分峰達到完全分離。

耐用性試驗中適當改變色譜條件，如流動相中磷酸溶液體積分數(shù)（0.08% ，0.10% ，0.12% ）、流速（0.9，1.0，1.1 mL／min）、柱溫（25，30，35 ℃），結果各考察因素在耐用性范圍內變動時，供試品中5-HMF 含量測定結果基本一致，表明流動相、流速和柱溫在一定限度內變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性較好。

試驗中收集了12 批市售腦心舒口服液（10 個不同生產(chǎn)企業(yè)），含量測定結果表明，12 批樣品中均檢出5-HMF，且各批次樣品間差異較大，最高質量濃度與最低質量濃度相差約200 倍，可見市售腦心舒口服液質量參差不齊。2015 年版《中國藥典（一部）》規(guī)定蜂蜜中5-HMF含量不得過0.004%［2］，按腦心舒口服液的處方工藝（蜂蜜占45%），理論計算制劑中5-HMF 含量最高為0.018 mg／mL，所檢測樣品中僅1 批的5-HMF 含量低于0.018 mg／mL。可見，腦心舒口服液中5-HMF 的來源很可能是制劑在處方制備過程中蜂蜜加熱煉制（90 ～100 ℃）［1］降解產(chǎn)生，有的廠家的5-HMF 含量尤其高，也可能為使用了劣質蜂蜜作為輔料或蜂蜜加熱煉制時間過長導致。

腦心舒口服液的用量為1 次10 mL，1 日2 次，而腦心舒口服液中5-HMF 的質量濃度范圍為0.006 1 ～1.247 mg ／ mL，則 最 大 日 暴 露 量 為24.94 mg，遠 超5 -HMF 作為第2 類基因毒性雜質限度的要求［3］。因毒性雜質在低濃度時即可造成人體遺傳物質的損傷，進而導致基因突變，甚至促使腫瘤發(fā)生［7］。蜂蜜雖是腦心舒口服液中的輔料，但輔料也是影響藥品安全性的重要因素，國內外越來越重視輔料的研究，輔料中降解雜質的毒副作用也應引起足夠重視。因此建議，生產(chǎn)廠家優(yōu)化處方制備工藝，改善樣品存儲溫度或選用更優(yōu)質的輔料，以降低樣品中5-HMF 的含量。同時，對5-HMF 進行質量控制，并納入腦心舒口服液的質量標準中，以提高產(chǎn)品的質量和用藥安全。